Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека 03. 02. 07 Генетика



Скачать 432,18 Kb.
страница1/2
Дата01.08.2018
Размер432,18 Kb.
ТипАвтореферат диссертации
  1   2




На правах рукописи

Буяновская Ольга Анатольевна

Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека

03.02.07 – Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН




Научный руководитель:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор медицинских наук Журков Вячеслав Серафимович





Профессор, доктор медицинских наук,

член - корреспондент РАМН

Дурнев Андрей Дмитриевич


Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится «07» июня 2010г. в 1200 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2010 г.


Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Мезенхимные стволовые клети (МСК) в последнее время стали объектом пристального внимания многих исследователей. Наибольший интерес связан с возможностью применения стволовых клеток в медицинских целях. Они по своим характеристикам являются перспективным типом «материала» для клеточной и генно-инженерной терапии (Бочков Н.П. с соавт., 2006; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Романов Ю.А., Смирнов В.Н., 2008). При культивировании стволовые клетки способны к продолжительной пролиферации, что дает возможность получать их в необходимом количестве, а также легко индуцировать дифференцировку в остео-, хондро-, мио-, адипогенном и др. направлениях (Егоров В.В. с соавт. 2003; Пальцев М.А. с соавт. 2006; Bruder S. et al. 1997, 1998; Zuk P.A. et al., 2001, 2002; Baksh D. et al. 2004). Для получения стволовых клеток c лечебными целями используются аспираты и образцы жировой ткани и костного мозга.

Однако, взятых из организма стволовых клеток для эффективной терапии недостаточно. Перед клеточной трансплантацией необходимо культивировать клетки.

Культивирование стволовых клеток сопряжено с воздействием на них различных факторов питательных сред и ферментной обработки при пересевах. Описанные в литературе случаи показывают, что длительное культивирование стволовых клеток может вести к серьезным изменениям генома, как на молекулярном, так и хромосомном уровнях его организации: описаны структурные и численные аномалии хромосомного набора клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Draper J. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Imreh M.P. et al., 2006; Krause D., Van Etten R., 2007; Spits C. et al., 2008), амплификация некоторых участков ДНК, метилирование промоторов, эрозия теломер с нарушением активности фермента теломеразы (Егоров Е.Е. с соавт., 2008; Sen S., 2000; Pathak S. et al., 2002; Rubio D. et al., 2005).

Генетические изменения и связанные с ними нарушения экспрессии генов могут вызывать селективную пролиферацию генетически аномальных клеток. Это может привести к манифестации стволовых клеток с онкогенетическими свойствами и, как следствие этого, к малигнизации после их трансплантации.

Вопрос об онкогенной безопасности и генетической изменчивости стволовых клеток остается мало изученным, но крайне важным и, по сути дела, определяющим дальнейшее развитие клеточной терапии.

На этом основании многие исследователи полагают, что практическое применение МСК в терапевтических целях пока преждевременно, и ему должно предшествовать более детальное изучение биологии стволовых клеток (Бочков Н.П. с соавт., 2007; Rubio D. et al., 2005). Применение клеток вообще, и в частности МСК, для терапевтических целей должно определяться данными по их безопасности для пациента, в том числе онкогенной (Бочков Н.П. с соавт., 2008; Duersberg P., Li R., 2003; Rubio D. et al., 2005). Многие вопросы размножения взрослых МСК хорошо изучены. Стали более понятными механизмы дифференцировки стволовых клеток, представления о генетической стабильности МСК в ходе культивирования. Однако, имеющиеся в литературе данные противоречивы, что объясняется разрозненностью методов изучения генетической изменчивости культивируемых МСК, незначительными выборками исследованных культур. Например, о хромосомной изменчивости, структурных нарушениях, численных аномалиях хромосом, являющихся постоянным спутником злокачественного роста, недостаточно судить на основе кариотипического анализа небольшого числа клеток, который выявляет структурные нарушения хромосом, но не позволяет оценивать численные отклонения в хромосомном наборе клеток.

Для оценки генетической изменчивости МСК, должны применяться не только стандартное кариотипирование, но и другие современные информативные методы молекулярной цитогенетики, в частности, исследование анеуплоидии в интерфазных клетках с помощью FISH анализа.



Цель и задачи исследования

Цель работы: Изучить численные нарушения хромосомного набора МСК, выделенных из жировой ткани и костного мозга на разных сроках культивирования с применением FISH-анализа интерфазных ядер.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:



  1. Изучить частоту анеуплоидных клеток в МСК из жировой ткани, культивируемых на ранних (2-5) пассажах (9-15) и поздних пассажах.

  2. Изучить частоту численных нарушений хромосомного набора МСК из костного мозга на разных сроках культивирования (2-12 пассажи).

  3. На основании полученных экспериментальных данных оценить параметры изменчивости по отдельным хромосомам и оценить механизмы, лежащие в основе происхождения разных вариантов анеуплоидии.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые данные, полученные по 4-м хромосомам (6, 8, 11 и Х), позволили оценить частоту анеуплоидии на 1 хромосому и рассчитать её в целом на хромосомный набор в культивируемых МСК из жировой ткани и костного мозга.

Показано, что в культурах МСК из разных источников происхождения на ранних и поздних пассажах общая частота спонтанной анеуплоидии существенно не различается, что свидетельствует о достигнутом равновесии между частотой возникновения анеуплоидных клеток и их элиминацией.

В результате проведенного исследования установлено, что на фоне высокой спонтанной частоты анеуплоидии в некоторых культурах может происходить селективное формирование клеточной популяции с однотипной хромосомной аномалией, обладающей преимуществом в размножении, что имеет определенное значение в оценке возможной онкогенности клонообразующих культур МСК.


Положения, выносимые на защиту

  1. Для культивируемых МСК как из жировой ткани, так из костного мозга характерна высокая частота спонтанной анеуплоидии, находящаяся в пределах 1-1,5% на одну хромосому. Этот показатель спонтанной частоты моносомии и трисомии характерен для культур МСК на ранних и поздних сроках культивирования.

  2. На поздних сроках культивирования обнаруживается формирование клеточных популяций с однотипной хромосомной аномалией, имеющих селективное преимущество в размножении.

  3. В большинстве культур МСК частота моносомии значимо выше трисомии, следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, являющегося общим для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно существенную роль играет механизм отставания хромосом в митозе.

  4. Полученные результаты демонстрируют значение молекулярно-цитогенетического метода в объективной оценке геномной изменчивости МСК и в выявлении культур с клонообразующими клеточными популяциями.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008 год); Стендовый доклад на пятом съезде ВОГИС (Москва, 2009); Основные положения доложены на заседании кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2009); Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 3 марта 2010 года.



Личное участие автора в получении результатов,

изложенных в диссертации

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен ею лично. Разработка протоколов исследования проведена при активном участии автора. Описание собственных исследований, обработка и обсуждение результатов, формулировка выводов и подготовка статей к публикации выполнены автором самостоятельно.



Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 8-ми печатных работах: 2-х статях и 6-х тезисах. Две статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата медицинских наук.



Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 96 стр. машинописного текста, иллюстрирован 19 таблицами и 2 рисунками. Библиографический указатель включает 131 источник отечественной и зарубежной литературы.



Материалы и методы исследования

Пробы жировой ткани и костного мозга были получены из лаборатории ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банка стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Пробы жировой ткани получены от 13-ти доноров (12 женщин, 1 мужчины). Забор проб проводился в стационарных условиях, в ходе косметической липосакции или абдоминопластики.

Пробы костного мозга получены от 16-ти доноров (3-х женщин, 13-ти мужчин). Забор проб проводился в операционных условиях путем пункции гребня подвздошной кости.



Методики культивирования

Культивирование клеток из жировой ткани. Источником получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани служил липоаспират. В лаборатории липоаспират разводили средой Хенкса в 2 раза и интенсивно встряхивали в течение нескольких минут, центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре. Пробы ткани отмывали 3-4 раза фосфатно-солевым буфером (рН=7,4) и суспендировали в равном объеме того же буфера с добавлением 1% бычьей сыворотки и 0,1% коллагеназы 1-го типа (Worthington Biochemical Corp.). Дезагрегацию ткани проводили на магнитной мешалке при температуре 37оС в течение 1 часа, затем центрифугировали 5 мин. при 300-500xG. Супернатант, содержащий зрелые адипоциты, удаляли. Клеточный осадок, представляющий собой фракцию клеток стромы и сосудов (фибробласты, перициты, эндотелий и др.), культивировали. Клетки высевали на пластиковые чашки Петри (Corning) диаметром 90 мм в ростовой среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Hyclone) и 1% инсулин-трансферрин-селенитом (Панэко). Клетки высевали на культуральные вентилируемые флаконы, помещали в СО2-инкубатор (370 СО2, 5% СО2). После 3-х дневной инкубации не прикрепившиеся клетки удаляли, ростовую среду полностью заменяли.

Далее культуры инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 до достижения 70%-90% конфлюентности, затем клетки снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду с плотностью 1500-2000 клеток\см2.

По мере роста клеток отбирали чашки с культурами, в которых, при фазовоконтрастном микроскопировании, отмечали преимущественный рост мелких мезенхимных клеток.

Культивирование клеток костного мозга. Костный мозг в количестве 10-15 мл, разбавляли в 4 раза физраствором, забуферным фосфатами (ФСБ) с Li-гепарином, и выделяли фракцию моноядерных клеток центрифугированием в течение 25 мин. при 650g. в градиенте Фиколла по методу Strauer B. et al. (2001).

Основной средой для культивирования была среда DMEM с низким содержанием глюкозы, эмбриональной телячьей сыворотки, аминокислот и антибиотиков. Концентрация моноядерных клеток для посева составляла около 1 млн./см2.

Клетки инкубировали в течение 34-48 часов в СО2 инкубаторе при 370С, после чего производили смену среды. Оставшиеся прикрепленные клетки оставляли для доращивания, до достижения 75-85% конфлюентности.

В дальнейшем смену среды проводили каждые 2-3 суток, в зависимости от результатов ежедневных осмотров состояния культур. При образовании колоний анализировали динамику их роста, клеточную морфологию.

Как и в жировой ткани, выявлялись три типа клеток: первый - маленькие веретенообразные клетки, второй – округлые и большего размера, чем первый, третий – клетки крупных размеров, фибробластоподобные.

Иммуноцитохимическое исследование культур МСК жировой ткани и костного мозга проведено в ЗАО «Реметэкс» и ГУЗ «Банком стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».



Приготовление цитогенетических препаратов. Все методические приемы: снятие клеток с флаконов, гипотонизация, фиксация для приготовления цитогенетических препаратов были щадящими.

Клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора версена (1 мин), а затем – 0,25% раствора трипсина (3-7 мин. при 37ºС). Далее добавляли среду DMEM (5 мл.), переливали полученную суспензию клеток в центрифужные пробирки. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали. Гипотонизацию проводили 0,55% раствором KCl (10 мин. при 37ºС), перед центрифугированием добавляли 3-5 капель фиксатора для остановки гипотонизации. Фиксацию проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом, с использованием 3-х смен фиксатора.



Перед раскапыванием клеточной суспензии на предметные стекла фиксатор меняли еще раз. На охлажденное стекло наносили 3-5 капель клеточной суспензии, а затем 2-3 капли фиксатора или ледяной уксусной кислоты, помещали стекло в подогретую влажную камеру или держали над водяной баней (60-70°С) 10-20 секунд, затем подсушивали над пламенем горелки или на твердотельной плитке при температуре 55-65°С, что улучшало качество препарата, необходимое для проведения FISH-анализа. Качества препарата оценивали с помощью метода фазового контрастного микроскопирования.

Анализ частоты анеуплоидии. В анализ включались интерфазные, хорошо распластанные с неповрежденной мембраной ядра, без наложений.

Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали зонды фирмы Vysis, Inc. (CEP6 (D6Z1), CEP8 (D8Z1) альфа-сателлитной ДНК для хромосом 6, 8, 11 и Х (рис. 1). Денатурацию препаратов проводили с 70% формамидом при 73°С в течение трех минут, гибридизацию - в течение ночи при 37°С. На следующий день препараты отмывали в растворе 0,4×SSC при температуре 70°С в водяной бане. Для контрастной окраски ядер использовали краситель DAPI.

FISH-препараты анализировали под микроскопом AxioImager с комплектом интерференционных фильтров (Zeiss) с помощью программного обеспечения для FISH-анализа (Fish View System, Applied Spectral Imaging GmbH).

От каждой культуры после реакции гибридизации исследовали в среднем по 1000 интерфазных ядер. Всего от каждой культуры клеток разных индивидов было исследовано более 97 тысяч ядер.



Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы Exel Microsoft Office (“Microsoft”), Statistica 6, Statictica 8. Уровень значимости p>0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.



а) Дисомия по хромосомам 6 и 8

б) Моносомия по 8 хромосоме





г) Трисомия по 6 хромосоме

е) Тетрасомия (тетраплоидия)

по хромосомам 6 и 8






Рисунок 1. Варианты интерфазных ядер, после реакции гибридизации




  1   2


База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница