Частота анеуплоидии в культурах мезенхимных стволовых клеток человека 03. 02. 07 Генетика



Скачать 432,18 Kb.
страница2/2
Дата01.08.2018
Размер432,18 Kb.
ТипАвтореферат диссертации
1   2

Результаты и обсуждение

На ранних (2-5) пассажах изучены численные нарушения хромосомного набора культивируемых МСК жировой ткани по хромосомам 6, 8, 11 и Х в 13 культурах.

Обобщенные данные FISH анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах, представлены в табл. 1.

По табл. 1 видно, что колебание общего показателя доли анеуплоидных (моносомных и трисомных) клеток по 4 хромосомам находятся в пределах от 1,0% до 2,5%.

Таблица 1

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на ранних пассажах

Хромосома

Тип анеуплоидии

Частота, %

Стандартное

отклонение



95% доверительный интервал

6

моносомия

1,5

1,2

0,8÷1,9

трисомия

0,4

0,4

0,3÷0,7

8

моносомия

2,1

1,3

0,9÷2,2

трисомия

0,4

0,5

0,3÷0,8

11

моносомия

1,0

0,8

0,6÷1,4

трисомия

0,1

0,2

0,1÷0,3

Х

моносомия

0,8

0,5

0,4÷0,9

трисомия

0,2

0,2

0,2÷0,4

Хотя разница показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительна, статистически достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).



Показатель частоты тетрасомии по изученным хромосомам оказался одинаковым - 0,6%. При этом, во всех культурах имело место полное совпадение на одном и том же препарате показателей частоты по двум изучаемым хромосомам. На основании этих данных правомочно говорить не о тетрасомии, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Результаты исследования численных аномалий хромосомного набора на ранних сроках культивирования МСК (2-ой-5-ый пассажи) показали, что в клетках имеет место геномная нестабильность, приводящая к появлению анеуплоидных и полиплоидных клеток. Результаты анализа культур МСК жировой ткани на ранних пассажах по четырем хромосомам позволяют подойти к оценке общей частоты анеуплоидии, включающей моносомию и трисомию. В настоящем исследовании тестировались 4 хромосомы, по которым суммарная частота анеуплоидии составила 6,5%. Соответственно, на одну хромосому частота моносомии и трисомии составила 1,6%, а на геном в целом – 37,4%.

На поздних пассажах (9-15 пассажи) исследовано 8 культур. Все эти культуры были исследованы на ранних пассажах.

Данные изучения анеуплоидии в МСК жировой ткани на поздних пассажах представлены в табл. 2.

Таблица 2

Геномная изменчивость в МСК жировой ткани на поздних пассажах

Хромосома

Тип анеуплоидии

Частота, %

Стандартное

отклонение



95% доверительный интервал

6

моносомия

1,1

0,8

0,5÷2,3

трисомия

0,3

0,3

0,2÷1,0

8

моносомия

1,5

1,2

0,9÷1,1

трисомия

0,8

0,9

0,6÷1,7

11

моносомия

0,4

0,5

0,3÷1,1

трисомия

0,2

0,4

0,2÷0,8

Х

моносомия

0,6

0,7

0,4÷1,5

трисомия

0,2

0,3

0,1÷0,6

Из представленных в табл. 2 данных видно, что показатели общей частоты анеуплоидии по 4-м хромосомам подвержены существенным колебаниям - от 0,6% (хромосома 11) до 2,3% (хромосома 8).

По хромосоме 11 и Х частота анеуплоидных клеток была более низкой, чем по хромосомам 6 и 8, а в большинстве культур имела место тенденция к понижению по сравнению с ранними пассажами.

Хотя колебания показателей частоты анеуплоидии между изученными культурами значительны, статистических достоверных различий средних частот между хромосомами не выявлено (р>0,05).

Расчеты показали, что суммарная частота моносомии и трисомии на одну хромосому составила 1,3%, а на весь геном - 29,3%.

Частота тетрасомии по изученным хромосомам находилась в пределах от 0,2% до 0,9%, и её средний показатель на геном составил 0,5%. Результаты 2-х-цветного FISH-анализа по всем препаратам позволяют говорить не о тетрасомном, а о полиплоидном состоянии хромосомного набора.

Анализ данных, представленных в табл. 1 и 2, показывает, что при сравнении ранних и поздних пассажей показатели уровня анеуплоидии на весь геном 37,4% и 29,3%, соответственно, находятся в статистически незначимых различиях. Сходство частоты анеуплоидии на ранних и поздних пассажах МСК из жировой ткани свидетельствует о том, что в ходе культивирования с высокой интенсивностью, кроме появления анеуплоидных клеток, происходит их элиминация в ряду клеточных делений. Так как большинство культур исследовано на 3-ем и 5-ом пассажах, можно предположить, что интенсивность анеугенеза и давление отбора против анеуплоидных клеток уравнивается уже на ранних пассажах, сохраняя эти показатели и на более поздних сроках культивирования – на 9-14 пассажах.

Аналогичное исследование проведено при анализе МСК костного мозга на ранних и на поздних пассажах, с использованием ДНК-зондов на хромосомы 6, 8, 11 и Х.

Результаты геномной изменчивости МСК костного мозга на ранних (3-5) и поздних (10-12) пассажах представлены в табл. 3 и 4.

Из табл. 3 видно, что показатель общей частоты анеуплоидных клеток на ранних пассажах по изученным аутосомам находился в пределах 1,2% -1,3%. Анеуплоидия по Х-хромосоме изучена в 13 культурах МСК мужского пола и в 7 культурах женского пола. В МСК мужского пола учитывали нулисомные, дисомные и трисомные клетки. Общий показатель нарушений по Х-хромосоме составил 1%, в подавляющей части за счет дисомии (т.е. ХХУ кариотипа).

Таблица 3

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на ранних пассажах

Хромосома

Тип анеуплоидных клеток, %

Моносомия

Трисомия

Тетрасомия

6

0,8±0,2

0,4±0,1

0,4±0,1

8

1,0±0,2

0,2±0,1

0,4±0,2

11

1,0±0,2

0,3±0,1

0,3±0,1

С учетом полученных данных оценено, что показатель анеуплоидии на одну хромосому составил 1,3%, а на весь геном - 27,6%.

Таблица 4

Геномная изменчивость в МСК костного мозга на поздних пассажах



Хромосома

Тип анеуплоидных клеток, %

Моносомия

Трисомия

Тетрасомия

6

0,6±0,3

0,5±0,2

0,7±0,3

8

0,7±0,2

0,3±0,1

0,6±0,3

11

1,0±0,2

0,2±0,1

1,1±0,2

Средняя суммарная частота анеуплоидии МСК костного мозга на поздних пассажах изученных аутосом находилась в статистически неразличающихся пределах - от 0,9% до 1,2%.

По Х-хромосоме данные получены по 6 культурам МСК мужского пола, среди которых выявлены клетки с дисомией с частотой 1,6%.

Соответственно приведенным данным видно, что общий показатель анеуплоидии на поздних пассажах составил на одну хромосому - 1,2%, а на геном - 27,6%.

Показатели частоты тетрасомии (полиплоидии) по изучаемым хромосомам в МСК костного мозга на ранних и поздних пассажах были в пределах 0,3%-0,4% - на ранних пассажах и 0,6%-1,1% на поздних.

Из представленных данных видно, что геномная изменчивость в МСК костного мозга оказалась одинаковой на ранних и поздних пассажах.

Эти данные совпадают с результатами изучения МСК из жировой ткани, что подтверждает сходство происходящих процессов при культивировании МСК разных тканей.

Таким образом, значения показателей анеуплоидии в МСК жировой ткани и МСК костного мозга находятся в одних и тех же пределах. Из этого можно сделать вывод, что источник (жировая ткань или костный мозг) стволовых клеток с точки зрения интенсивности геномной изменчивости значения не имеет.

О структуре геномной изменчивости можно судить по данным, представленным в табл. 5.

Таблица 5

Структура геномной изменчивости МСК

Жировая ткань

Костный мозг

Ранний пассаж

Хромосома

Доля моносомии, %

Доля трисомии, %

Доля моносомии, %

Доля трисомии, %

6

1,5

0,4

0,8

0,4

8

2,1

0,4

1,0

0,3

11

1,0

0,1

1,0

0,3

Х

0,8

0,2

0,1

0,9

Поздний пассаж

6

1,1

0,3

0,6

0,5

8

1,5

0,8

0,7

0,2

11

0,4

0,2

1,0

0,3

Х

0,6

0,2






Исходя из представленных в табл. 5 данных по структуре геномной изменчивости в МСК изученных тканей, видно, что доля моносомных клеток во всех культурах существенно превосходит долю трисомных клеток.

Разница средних частот моносомии и трисомии по отдельным хромосомам статистически не достоверна (p>0,05).

Однако, сравнение частот двух типов анеуплоидных клеток - моносомных и трисомных - показало, что имеются достоверные различия между ними (р<0,01).Частота моносомных клеток выше трисомных.

Это ожидаемый результат, так как кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих видов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении, который, судя по представленным данным, занимает весьма существенное значение.

В изученных нами культурах МСК из жировой ткани не наблюдалось существенных различий между частотой числовых нарушений по отдельным хромосомам. Этот факт не дает оснований полагать, что определенные хромосомы, различающиеся по длине и расположению центромеры, предпочтительнее вовлекаются в процессы анеугенеза. Следовательно, выявляемая в культивируемых клетках анеуплоидия является результатом случайного вовлечения хромосом в механизмы процесса нерасхождения или отставания.

Это положение имеет и теоретическое обоснование, так как, исходя из механики движения хромосом в анафазе, их распределение по дочерним клеткам не зависит от длины, а связано с взаимодействием микротрубочек веретена с кинетохором (Wuttke K. et al. 1997).

Полученные результаты по изучению культур МСК разных тканей выявили большой «объём» геномной изменчивости, что можно трактовать как свойство культивируемых стволовых клеток.

На поздних пассажах, наряду с выявлением спонтанной анеуплоидии, обнаружен и другой, более существенный факт генетической изменчивости МСК: на фоне высокой спонтанной нестабильности генома может происходить селективная пролиферация клеток с однотипной хромосомной аномалией.

В табл. 6 и 7 обобщены данные по четырем культурам МСК из жировой ткани, в которых частота анеуплоидии значительно превышала 95% доверительный интервал.

Таблица 6

Частота анеуплоидных клеток в отдельных культурах МСК на поздних пассажах, в которых наблюдается высокий уровень мозаицизма, который можно принять за клонообразование



Тип аномалии

6-ая хромосома

8-ая

хромосома



11-ая

хромосома



Х

хромосома



Культура №1

моносомия

19,9

0,8

0

0,6

трисомия

0

0,7

0

0

тетрасомия

0

0,4

0

0

Культура №2

моносомия

2,3

4,4

0,1

1,6

трисомия

0,5

0,7

0,1

0,1

тетрасомия

0

0

0

0

Культура №3

моносомия

21,2

0,6

0,4

0,1

трисомия

1

1,4

0

0,4

тетрасомия

1,4

2,6

0

0

Культура №4

моносомия

5,6

3,0

0

0,6

трисомия

2,7

2,5

0

0

тетрасомия

3,3

2,7

0

0

Статистически доказано, что моносомия по хромосоме 6 в культуре №1 (19,9%), №3 (21,2%) и №4 (5,6%) является неслучайным событием. Высокие показатели анеуплоидии в этих трех культурах свидетельствуют о том, что в культурах №1 и №3 уже на ранних пассажах, видимо, произошло селективное размножение клеток с моносомией по хромосоме 6, с образованием колоний, имевших в несколько раз большую скорость клеточного деления.

Что касается культуры №2 (табл.6) , в которой частота моносомии по хромосоме 8 составила 4,4,%, статистически обосновать клонообразование не удалось (p=0,07%), вероятно, из-за недостаточной выборки проанализированных клеток и сравнительно высокой частоты моносомии на ранних пассажах. Так или иначе, данные по этой культуре должны скорее настораживать и относить такие культуры с потенциальными свойствами к клонообразованию.

Если вопрос о мозаичности (клональном характере) культур № 1, № 3 и №4 не вызывает сомнений, то возникает вопрос – при какой частоте анеуплоидных клеток культуры можно относить к мозаичным с наличием клонов? Сложность ответа на этот вопрос заключается в пока неизученных закономерностях динамики клеточных популяций, в которых появляются аномальные клетки, а также в технических особенностях пересева культур. Вполне очевидно, в решении этих вопросов требуются соответствующие статистические обоснования, а так же разработка методического подхода к анализу клонообразования, аналогичному мозаицизму в клинической цитогенетике (Кулешов Н.П., 1978).

Таблица 7

Характеристика клонов в культурах МСК



№ культур

Характеристика клонов

Доля

анеуплоидных клеток, %



Культура

Срок фиксации

1

Моносомия

Хромосомы 6

19,9

Жировая ткань поздний пассаж

14-ый пассаж

3

Моносомия

Хромосомы 6

21,2

Жировая ткань поздний пассаж

9-ый пассаж

4

Моносомия

Хромосомы 6

5,6

Жировая ткань поздний пассаж

10-ый пассаж

При изучении МСК костного мозга одна культура обратила на себя внимание. Это культура исследовалась трижды: на 2-ом, 6-ом и 12-ом пассажах. Результаты представлены на рис. 2.



Рисунок 2. Показатели трисомии хромосомы 8 в МСК костного мозга

на разных пассажах.
На 2-м пассаже частота трисомных клеток хромосомы 8 составила 23,4% , на 6-ом пассаже - 34,3%, а на 12-ом пассаже - 16,1%. То, что к 6-му пассажу частота трисомии возросла вполне объяснимо: трисомная популяция клеток имела преимущественную селективную пролиферацию, возможно, за счет ускоренного деления клеток. Возникает вопрос при анализе культуры на 12-м пассаже, почему в ней обнаружено лишь 16,1% трисомных клеток. Вместо ожидаемого увеличения трисомных клеток (если это клонообразование) имеет место существенное снижение их частоты. Объяснение этому факту однозначно дать трудно, так как это может быть связано с каким-то отклонением в пересеве клеток, в методических отклонениях при отборе клеток для FISH-анализа, или же это редкий случай, когда под действием каких-то факторов (культуральных, клеточных и др.) подавляется пролиферация аномальных клеток, достигших предельной частоты.

Безусловно, данная культура требует дальнейшего изучения с привлечением разных клеточно - культуральных технологий.



Пример трисомии хромосомы 8 демонстрирует, что динамика доли анеуплоидных клеток может идти в сторону увеличения и понижения и зависит от количества пассажей.

Таким образом, из характеристики клонов видно, что они могут возникать на ранних и на поздних пассажах, но сравнить их из-за недостаточного количества данных не представляется возможным.

Наличие клонов на ранних пассажах, может говорить о том, что они могли быть внесены в культуру из организма.

Выводы

  1. Частота анеуплоидии в МСК из жировой ткани по разным хромосомам (6, 8, 11 и Х) на ранних и поздних пассажах одинаковая (37,7%, 29,3%, соответственно). Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет 1,2%.

  2. Частота анеуплоидных клеток в МСК из костного мозга по разным хромосомам (6, 8, 11, Х) на ранних и на поздних пассажах не различается. Общий показатель частоты анеуплоидии на одну хромосому составляет на ранних пассажах 1,6%, на поздних пассажах 1,3%.

  3. Расчетная частота анеуплоидии МСК жировой ткани на весь геном составляет на ранних пассажах 37,4%, на поздних пассажах 29,3%, в МСК костного мозга 27,6% на ранних и поздних пассажах.

  4. Полученные данные о сходных величинах анеуплоидии на ранних и поздних пассажах свидетельствует о равновесии между частотой возникновения de novo анеуплоидных клеток и их элиминацией.

  5. Доля моносомных клеток во всех культурах существенно превышает долю трисомных клеток. Следовательно, кроме механизма нерасхождения хромосом, общего для обоих типов анеуплоидии, в происхождении моносомии дополнительно лежит механизм отставания хромосом при клеточном делении.

  6. В изученных культурах МСК выявлено формирование клеточных популяций с однотипным аномальным кариотипом, обладающих селективным преимуществом в размножении.

  7. Полученные данные о высоком уровне анеуплоидии и о возможном клонообразовании при культивировании МСК указывают на необходимость проведения тщательного генетического мониторинга МСК в случае использования их для целей клеточной терапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

  1. Бочков Н.П., Гольдштейн Д.В., Ржанинова А.А., Никитина В.А., Воронина Е.С., Буяновская О.А. /Оценка генетической безопасности клеточной терапии //Сборник тезисов Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» - г. Москва. – 2007г. – С. 89-90.

  2. Nikitina V.A., Buyanovskaya O.A., Voronina E.S., Kosyakova N.V. /The frequency of aneuploidy in human multipotent mesenhimal stromal cells // Materials of the 37th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society. – Basel, Switzerland, September 9-13. – 2007г. – P. 147.

  3. Никитина В.А., Косякова Н.В., Буяновская О.А., Бочков Н.П. Анеуплоидия в стволовых клетках человека//Генетика человека и патология – г. Томск: Из-во: «Печатная мануфактура». – 2007г. – вып.8. – С. 246.

  4. Буяновская О.А., Никитина В.А. /Характеристика анеуплоидии в стволовых клетках человека //Сборник тезисов V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Вестн. РАМН, приложение - г. Москва. – 2008г. – №6. – С. 77-78.

  5. Бочков Н.П., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Буяновская О.А., Катосова Л.Д. /Анеуплоидия в стволовых клетках, выделенных из жировой ткани человека //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – г. Москва. – 2008г. – Т. 146, №9. – С. 320-323.

  6. Буяновская О.А., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Воронина Е.С., Катосова Л.Д., Бочков Н.П. /Спонтанная анеуплоидия и клонообразование в стволовых клетках человека при разных сроках культивирования. // Клеточные технологии в биологии и медицине - г. Москва. – 2009г., № 3. –С. 123-127.

  7. Бочков Н.П., Никитина В.А., Буяновская О.А., Кулешов Н.П. Спонтанная анеуплоидия и клонообразование при культивировании стволовых клеток / Сборник тезисов. Пятый съезд ВОГИС II часть - г. Москва – 2009г. - С. 257.

  8. Буяновская О.А., Никитина В.А. /Тезисы к 40-летию МГНЦ РАМН Медико-генетический научный центр РАМН «Численные аномалии хромосомного набора в культивируемых МСК». // Медицинская генетика - г. Москва – 2010г., №12 - С. 34.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2


База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница