Экзаменационные вопросы по геномике и протеомике


Часто повторяющиеся последовательности



страница2/4
Дата01.08.2018
Размер1,98 Mb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4

1. Часто повторяющиеся последовательности: 1) Сателлиты 2) Микросателлиты 3) Минисателлиты 4) Макросателлиты.

1.1) Сателлиты. Содержание в г-ме эу: 5-50%. Это оч.длинные (в неск.сотен т.п.н.) уч-ки ДНК с тандемно повторяющимися короткими блоками (5–200 п.н.). Хар-ны для конститутивного нетранскрибируемого гетерохроматина. Типичны для г-ма чел.: α-сателлиты. Сущ.также β- и γ-сателлитные.

1.2) Микросателлиты. Высокополиморфны. Это тандемные повторы 1-4 п.н, организованы в блоки до 200 п.н., к-е рассеяны по г-му. Транскрибируются. Длина мксателлитов и их общее кол.в г-ме коррелирует с разм.г-ма.

1.3) Минисателлиты. НП длиной 5-50 пн. Ф-мир-т блоки промеж.разм. до 104 п.н. Локализованы в разн.уч.хр-м. У чел.есть 2 типа минис-х НП: 1.3.1. гипервариабельные минисателлиты 1.3.2. теломерные НП. с повторяющейся единицей 5'-TTAGGG-3', длина повторов – 10–15 т.п.н.

1.4) Макросателлиты. Хар-ся большим разм.повторяющеся ед. (> 1 т.п.н.).

2. Умеренно повторяющиеся последовательности:

2.1) Мобильные генетические элементы: а) ДНК-транспозоны, б) Ретроэлементы,

2.2) LINE-элементы,

2.3) SINE-элементы,

2.4) Генные семейства

2.1) Мобильные генетические элементы. НП ДНК, способные изм.свое положение в г-ме, т.е.совершать акты транспозиции.

2.1.а ДНК-транспозоны. Транспозиция осущ-ся по мех.вырезания и вставки с уч.транспозазы=>дупликация короткой НП в сайте интеграции транспозона недалеко от старого, в соответствии с этим, процесс перемещения ДНК-транспозонов получил название «локальных прыжков».

2.1.б Ретроэлементы. Исп.в своем мех.обр-ю транскрипцию.

2.1.б.1) LTR (long terminal repeats) – сод.р-роэлементы, вкл-е р-ротранспозоны и эндогенные р-ровирусы,

2.1.б.2) ретроэлементы, не сод-е LTR, составленные из длинных (LINE - long interspersed elements) и кор-их (SINE - short interspersed elements) диспергированных элем-в. У этих мобильных генетических элем.реализация акта транспозиции требует транскрипции их г-мной НП, обратной транскрипции образовавшейся мРНК и интеграции кДНК в новый генетический локус (механизм «копирования и вставки». Особенностью структуры ретротранспозонов явл.наличие на концах длинных концевых повторов (LTR), к-е сод.НП, участвующие в регуляции их транскрипции. Р-ротранспозоны обладают генами, обеспечивающими их репликацию. Выс-я представленность транспозонов свид-вует об их ключ.роли в эво.эу.г-ма.

2.4 Генные сем-ва.

Сост.из генов, для к-х хар-на выс.гомология НП. Парологи – гены, объед-е общностью происх.ч/з дупликацию г-в-предшественников. Это гистоновые г-ы, г-ы рРНК, тРНК и мя РНК. Ф-ционирование генов мультигенных сем-в контролирует формирование сист.распознавания разл.сигналов. Самое большое из известных генных семейств позвоночных ж-х составлено генами и псевдогенами обонятельных рецепторов.

3. Уникальные последовательности. Встр-ся только 1 р. Большая часть из них – некодирующие гены. Сост-т 15-98% г-ма. Хорошо известным примером уникальных НП являются интроны, общий размер к-х превышает суммарный размер экзонов соответствующих генов. Мозаичная экзон-интронная структура генов обнаружена у представителей большинства таксономических групп. Интроны делят на 4 класса. У чел.г-ы «дом.хоз-ва» им.меньшую длину в кодир.и некодир.частях, чем г-ы «роскоши» спец-из-х тк-й.

Псевдогены - это неактивные копии исх-х г-в, изм-х мутациями. Рассеяны по всему г-му. Одна из разновидностей таких НП составлена процессированными псевдогенами, в которых отсутствуют интроны гена-предшественника. Содержание псевдогенов у представителей разных таксономических групп значительно различается. Больше всего псевдогенов найдено у человека (3600–19000). Предполагается участие псевдогенов в иммунном ответе человека и животных, причем для птиц это уже доказано. Многие псевдогены эу. высоко консервативны и активно транскрибируются, а некоторые могут быть активированы точковыми мутациями.

Изохоры - это дискретные, протяженные(сотни т.п.н.), высокогомогенные по GC-составу уч. Их делят на неск.«легких» и «тяжелых» сем-в (по сод.GC): L1, L2, H1, H2 и H3 (L – light, H – heavy). В г-ме человека наиболее GC-богатые изохоры имеют самую высокую плотность расположения генов («сердцевина г-ма» – «genome core»), а для изохор с небольшим содержанием GC, характерна низкая концентрация генов («г-мная пустыня» – «genome desert»).

Постепенно происх. изм.критериев, на осн-и к-х оценивают ф-ц-ность НП. Главным становится эво-я консервативность, отражающая наличие давления естественного отбора, направленного на поддержание их структуры, а сл-но и ф-ции.


20.Пространственная организация генома.

Геномная ДНК всех эукар-х орган-ов, суммарная длина кот. для одной копии генома может достигать неск-х метров, нах-ся в составе высокоупорядоченного нуклеопротеинового комплекса, наз-ого хроматином. Это позволяет ей помещаться, воспроизводиться и сохранять функц-ую активность в ядрах, диаметр которых не превышает нескольких мкм. Белки, обеспеч-ие пространственную укладку ДНК в индив-ных хромосомах, можно рассматривать в качестве своеобразных ДНК-шаперонов. Морфология интерфазного ядра. Объем ядер сомат-х клеток жив-х сост-ет ~600–1500 мкм3. Ядерная оболочка, формирующая интерфейс м/у ядерными и цитоплазм-ми компартментами, играет основ. роль в поддержании внутри ядра уникальных биохим. условий, необх. для функционирования ген. аппарата клеток. Она построена из внеш. и внутр. ядерных мембран, кот. пронизывают 103–104 ядерных поровых комплексов, обеспечивающих транспорт в обоих направлениях высоко- и низкомолекулярных соединений, необх-х для функц-ия ядра и/или являющихся продуктами его жизнедея-ти. Наружная мембрана взаимод-ет с рибосомами и яв-ся частью шероховатого ЭПР клетки. Внутренняя мембрана осущ-ет контакты с хроматином и маркирована специф-ми мембранными белками. Ядерный матрикс яв-ся вторым (после хроматина) компонентом ядер, содер-им нукл. к-ты. Его обнар-ют в ядре в виде сетчатой, фибриллярной, рибонуклеопротеин-содержащей структуры. Ядрышко яв-ся хорошо изученным ядерным субкомпартментом, кот. обесп-ет биогенез рРНК и рибосомных 40S и 60S субчастиц и обнар-ся у всех эукариот. В ядре присут-ют многочисленные тельца (bodies), кот. не яв-ся фиксированными внутриядерными компартментами, но отражают активность генома в интерфазе, и их сущ-ние в ядре часто не превышает неск. минут (тельца Кахаля, свернутые тельца и др.). В интерфазном ядре различают хроматин двух типов: Эухроматин - участки генома организованы менее компактно и заняты активно экспрессирующимися генами. Гетерохроматин - геномная ДНК сильно конденсирована и не транскрибируется. Возможна гетерохроматизация эухроматина. Компактизация эукариотической ДНК в интерфазных ядрах контр-ся на трех уровнях межмол-ных взаимод-ий, обеспеч-их пространств-ую организацию хроматина. Нуклеосома - фундаментальная структурная повтор-яся единица хроматина. Основная ее часть построена из 4 гистоновых белков (двух димеров H2A–H2B и тетрамера (H3)2–(H4)2), а молекула ДНК обернута двумя витками вокруг этого белкового октамера. Каждая нуклеосома содержит ~165 п.н. ДНК, данный параметр зависит от вида организма и типа клеток. В составе хроматина нуклеосомы следуют друг за другом и разделены короткими участками так называемой линкерной ДНК длиной ~10–80 п.н. Включение ДНК в состав нуклеосом сопров-ся уменьш-ем ее линейного размера в ~5–10 раз. Первичная структура генома заключает в себе нуклеосомный код – инф-ию, привяз-ую процесс образ-ия нуклеосом к опред-ным ПН (позиционирование нуклеосом), кот. периодически повтор-ся вдоль протяженных участков ДНК. ПН вдоль молекул ДНК может определять и фундаментальные особенности ее вторичной структуры – сайты перегиба ДНК (bend sites), кот. обнар-ют в среднем через каждые 4 нуклеосомы. Наличие сайтов перегиба коррелирует с правилами сегментации эукариотического генома, в соответствии с кот-ми геном может быть описан в виде следующих друг за другом блоков НП длиной в ~350 п.н. (две нуклеосомы). Фибриллярная структура хроматина. В присутствии линкерного гистона H1 и/или ионов двухвалентных металлов нуклеосомная нить претерпевает дальнейшую компактизацию с образ-ем структуры – компактной фибриллы диаметром ~30 нм. Хромосомные территории. Хромосомы занимают в интерфазных ядрах более или менее четко разграниченные области. Расположение хроматина и хромосомных территорий в интерфазных ядрах упорядочено и эволюционно консервативно у жив. и раст. Структурные аналогии с организацией белков. Первичная структура хроматина форм-ся в конкретной хромосоме из ПН нуклеосом в нуклеосомной фибрилле диаметром 10 нм. Его вторичная структура представлена компактной фибриллой диаметром 30 нм. Последняя, в свою очередь, формирует домены хроматина в виде петель, розеток и сильно конденсированного хроматина, что можно рассматривать как прототип его третичной структуры. Организованные подобным образом хромосомы представлены внутри интерфазного ядра взаимодействующими друг с другом хромосомными территориями, которые в совокупности формируют четвертичную структуру эукариотических ядер. При этом перестройки хроматина под действием регуляторных факторов напоминают механизмы аллостерической регуляции ферментативной активности.
21. Причины изменчивости генома эукариот.

Причины изменчивости генома эукариот: запрограммированные изменения структуры генома, эндогенный мутагенез,молекулярные механизмы изменения размеров .



Запрограммированные изменения структуры генома:

1) Амплификация генов в соматических клетках эукариот

2) Изменения первичной структуры генома в онтогенезе эукариот:

а) Деминуции хроматина,

б) Изменения генов иммуноглобулинов,

в) Изменения генов, кодирующих антигены,

г) Репаративный синтез ДНК в измененных участках матрицы с низкой точностью.

1) Амплификация генов в соматических клетках эукариот

Во время разв.нек-х эу-х орг-в в г-ме сомат-х кл-к происх.большое увел.числа копий (амплификация) нек-х генов. Этот генетически детерминированный процесс направлен на повышение уровня экспрессии генов путем умножения числа матриц для транскрипции. В основе избирательной соматической амплификации ген-х локусов лежит повторяющаяся инициация репликации (эндорепликация) соотв-х репликонов на протяжении одного клеточного цикла (эндоцикла). Явл.шир.р-нено у раст.

2а) Деминуции хроматина

Деминуции - высокоточное, генетически детерминированное удаление протяженных участков гетерохроматина, содержащих некодир. НП ДНК.

2б) Изменения генов иммуноглобулинов

Разнообразие антител и рецепторов антигенов, требуемое для полноценного иммунного ответа, создается в результате высокоспецифичных, генетически детерминированных изменений НП геномной ДНК лимфоцитов

2в) Изменения генов, кодирующих антигены

Одной из стратегий, с пом.к-й паразитические эу.избегают нейтрализующего действия иммунной сист.организма-хозяина, явл.постоянное изм.антигенных детерминант, локализованных на поверхности их тела, что достигается путем мутационного изменения соответствующих генов в процессе репликации или репарации ДНК, рекомбинации м/у разл-мися генами или перетасовкой сегментов генов, расположенных в разн.уч-х г-ма.

2г) Репаративный синтез ДНК в измененных уч.матрицы с низкой точностью

В синтез ДНК у эу.вовлечены более 19 ДНК-полимераз. Около половины из них осущ.синт.ДНК с высокой точностью, др-е же исходно запрограммированы на включение с большой частотой некомплементарных матрице н/дов и способны копировать поврежденную ДНК.

Мутаций:

В зависимости от причин, вызывающих мутации бывают: спонтанные и индуцированные.

Эндогенный мутагенез, обусловленный внутренними причинами, лежит в основе возникновения спонтанных мутаций.

Причины возникновения спонтанных мутаций

1. мол-ы ДНК in vivo хар-ся хим.нестабильностью.

2. ошибки синтеза ДНК in vivo. При репликации хромосомной ДНК происходит ошибочное включение нуклеотидов (misinsertion), некомплементарных матричной цепи ДНК с частотой 10–7–10–8/нт.

3) в процессе нормальной жизнедеятельности эу.кл.обр-ся многочисленные эндогенные мутагены, к-е после взаим-я с ДНК повреждают н/ды, что иногда может изменить ее кодир. потенциал.

Системы защиты генома от эндогенного мутагенеза

1) Антимутагены

С участием антимутагенов (ферментов и низкомолекулярных соединений-ловушек свободных радикалов) происходит хим.или ферментативная инактивация мутагенов, а также подавление метаболической активации промутагенов.

Примеры ловушек: витамины (α-токоферол, аскорбиновая и липоевая кислоты, β-каротин), убихиноны, свободный цистеин, а также глютатион.

2) Поли(ADP)-рибозилирование

Посттрансляционная модификация белков линейными и разветвленными гомополимерными цепями, построенными из остатков ADP-рибозы, осуществляемую полимеразами поли(ADP-рибозы) (PARP), которые используют NAD+ в качестве субстрата (источника мономера).

3) Три системы репарации ДНК (Ни одна из котрых не обладает абсолютной эффективностью): a). эксцизионная репарация использующая удаление азотистых оснований (BER), b). система инцизионной репарации – удаление нуклеотидов (NIR),

c). система коррекции ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR) вносят основной вклад в восстановление повреждений ДНК, вызванных свободными радикалами разной природы.

Молекулярные механизмы изменения размеров генома:

1) Полиплоидизация

Это увеличение размера генома, кратное его гаплоидной части.

При этом происходит не возрастание размера генетических элементов генома, а увеличивается их общее число.

2) Сегментные дупликации, вставки и делеции

Это локальные изменения числа копий НП отдельных участков (сегментов) генома, получивших название сегментных дупликаций или малокопийных повторов (число копий – не менее двух, длина – от 1 до >200 т.п.н., гомология – 90–100%).

3) Активность транспозонов

Это амплификация LTR (long terminal repeat)-содержащих транспозонов, уровень и спектр активности которых сильно различаются у разных видов.

4) Приобретение новых генов

Предполагается, что именно дупликации генов и целых геномов лежат в основе повышения фенотипической сложности эволюционирующих видов.

5) Двунаправленные изменения размеров генома

Имеет место и его увеличение, и сжатие!


22. Причины возникновения спонтанных мутаций и системы защиты генома от эндогенного мутагенеза.

В зависимости от причин, вызывающих мутации бывают:



Спонтанные мутации – возникают самопроизвольно в норм.усл.сущ-я.

Индуцированные мутации – появляются в рез.мутагенных воздействий окр.среды или в эксперим-х усл-ях под действ.разл.мутагенных факторов.

Прич.возникновения спонтанных мутаций.

1. мол-ы ДНК in vivo хар-ся хим.нестабильностью.

2. ошибки синтеза ДНК in vivo. При репликации хромосомной ДНК происходит ошибочное включение н/дов (misinsertion), некомплементарных матричной цепи ДНК с частотой 10–7–10–8/нт.

3) в проц.норм.жизнед/и эу.кл.обр-ся многочисленные эндогенные мутагены, к-е после взаим-я с ДНК повреждают н/ды, что иногда может изменить ее кодир. потенциал.

Эндогенный мутагенез лежит в основе возникновения спонтанных мутаций. В рез.повреждения ДНК или вкл-я в ее цепь неправильного н/да возникает премутация, к-я после репликации превращается в мутацию, если не справляется система репарации.

Системы защиты генома от эндогенного мутагенеза

1) Антимутагены.

2) Поли(ADP)-рибозилирование.

3) 3 сист.репарации ДНК (все 3 не обладает абсолютной эффективностью):

- эксцизионная репарация, исп-я удаление азотистых осн-й (BER – base excision repair),

- система инцизионной репарации (NIR – nucleotide incision repair),

- система коррекции ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR – mismatch repair) вносят основной вклад.

Антимутагены. С их участием (ферментов и низкомол-х соед-й-ловушек своб.радикалов) происх.хим. или ферментативная инактивация мутагенов, подавление метаболической активации промутагенов. Примерами низкомол-х ловушек: витамины (вит.С, β-каротин), убихиноны, свободный Cys, глютатион.

Эксцизионная репарация. Может инициироваться 11 ДНК-гликозилазами. Они удаляют их из ДНК путем расщепления N‑гликозидных связей с обр.AP-сайтов.

В случае точечной (short-patch) BER происходит замена 1 н/да AP-сайта, во время сегментной (long-patch) BER заменяются 2–6 н/дов в самом сайте и его окрестностях.



Инцизионная репарация. AP-эндонуклеаза вносит одноцепочечный разрыв у 5'-конца поврежденного н/да, а обр-ся 3'-конец ДНК исп-ся далее ДНК-полимеразой для инициации синтеза ДНК с последующим удалением поврежденного н/да.

Сист.коррекции ошибочно спаренных н/дов. Удаляет н/ды, к-е избежали корректирующего действия ДНК-полимеразы. Белки MMR распознают ошибочно спаренные н/ды ДНК и взаим-т с ними, инициируя исправление ошибки, а также выступая в качестве сенсоров повреждений ДНК, активируя при необходимости точки контроля кл.цикла или апоптоз.

Поли(ADP)-рибозилирование. Посттрансляционная модификация белков линейными и разветвленными гомополимерными цепями, построенными из остатков ADP-рибозы. Осущ-ся полимеразами поли(ADP-рибозы) (PARP).
23.Молекулярные механизмы изменения размеров генома.

В основе феномена вариабельности размеров генома у жив-х и раст. лежат несколько молекулярных механизмов, реализация кот-х приводит к структурным перестройкам генома. Данные механизмы не яв-ся взаимоисключающими и часто дополняют друг друга. Так, полиплоидизация может приводить к активации транспозонов, что, в свою очередь, нередко сопровож-ся хромосомными перестройками. Механизмы. Полиплоидизация. Это увел. размера генома, кратное его гаплоидной части. При этом происходит не возрастание размера ген-ких элементов генома, а увел-ся их общее число. Полиплоидия у цветковых раст. возникает с высокой частотой. Среди позвоночных жив-х частое возникновение полиплоидии отмечено у рыб и лягушек, но не встречается у представителей высших таксономических групп. Широкое распространение полиплоидии в природе указывает на то, что полиплоиды обладают селективными преимуществами перед их диплоидными предками. Сегментные дупликации, вставки и делеции. Это локальные изменения числа копий НП отдельных участков (сегментов) генома, получивших название сегментных дупликаций или малокопийных повторов (число копий – не менее двух, длина – от 1 до >200 т.п.н., гомология – 90–100%). Сегментные дупликации занимают ~5% генома человека, а также ~2% и ~ 3% в геномах мышей и крыс. Активность транспозонов. Одним из важных факторов увеличения размера генома яв-ся амплификация LTR-содержащих транспозонов, уровень и спектр активности кот-х сильно различаются у разных видов. Кол-во транспозонов в геноме может возрастать на 20–100 копий (~0,1–1,0 м.п.н.) за одну генерацию. При этом основной вклад в экспансию генома разных видов могут вносить разные семейства транспозонов. Н-р у дикого риса Oryza australiensis, активность нескольких семейств LTR-содержащих транспозонов за короткий промежуток времени обеспечила увеличение размера генома до современного уровня. Следствием активности L1-транспозонов яв-ся интеграция (ретротранспозиция) НП из пула зрелых мРНК клетки (через копии кДНК) в новые ген. локусы генома. В результате LINE-1-зависимой обратной транскрипции мРНК и послед. встраивания в геном образовавшейся кДНК, в геноме млекопитающих возникло более 4000 безинтронных копий клеточных псевдогенов. При этом около 1/3 таких псевдогенов транскрибируются. Приобретение новых генов. Дупликации генных НП, рассмат-ся в качестве ключевого механизма, лежащего в основе возникновения генов с новыми функциями и увеличения кодир. части генома. Дупликации генов и целых геномов лежат в основе повышения фенотип-ой сложности эволюционирующих видов. Двунаправленные изменения размеров генома. Эволюционные преобраз-ия био-х видов сопров-ся двунаправленными изменениями размеров генома. Анализ первичной структуры современного генома небольшого размера у Arabidopsis показывает, что умен-ие его размеров после полиплоидизации сопровождалось неслучайным удалением дуплицированных генов и высокоспециф-им избир-ным увел-ем протеома этого растения. Отмечена связь вероятности задержки или удаления дуплицированного гена из полиплоидного генома с его функцией.
24. Межвидовые и внутривидовые различия в размерах генома животных и растений.

У р-й большие разм.г-мов у папоротников, однодольных и голосеменных. Однако разм. г-мов и в др-х таксономических гр-х р-й варьируют в шир-х пределах. Даже геномы диплоидных злаков, отн-но «молодых» видов, разл-ся по своим разм.более чем в 30 р.

У позвоночных ж-х особ.большими г-мами обл-т представители хрящевых и двоякодышащих рыб, а также амфибий. Для многочисл-й гр.ж-х хар-на значительно меньшая вариабельность в разм.г-ма. Большие г-мы хар-ны для прямокрылых нас-х (кузнечики) и ракообразных (некоторых видов креветок). Геномы жуков, мух и бабочек

компактны и хар-ся малым разбросом по разм. Г-м моллюсков оч.компактен, разм.<6 пг.

У ж-х ~3300-кратный размах межв-х раз-й разм.г-ма, у наземных р-й «всего лишь» ~1000-кратные различия (от 0,11 пг до 127,4 пг). Но размеры наименьшего г-ма водоросли и наиб-го г-ма покрытосемянных растений различаются более чем в 8500 раз.

У ж-х наименьшим из г-мов обл.один из типа Пластинчатых(0,04 пг). Самым большим из известных геномов (~132пг) обл.мраморная двоякодышащая рыба Protopterus aethiopicus (для сравнения размер генома человека составляет ~3,5 пг). Разл-я в разм-х г-ма у беспозвоночных: 340-кратные у плоских червей, 240 – у ракообразных, 190 - у насекомых, 70 – у паукообразных, 40 – у нематод, 15 – у моллюсков, 9 – у иглокожих.

Разм.гипотетических г-мов-предшественников у покрытосемянных р-й и мохообразных хар-ся оч.малым разм-м (≤1,4 пг), тогда как для г-ма-предшественника голосеменных р-й и папоротников хар-ны промеж-е разм. (3,5–14,0 пг). Считается, что в проц.эво.г-мов могло происх.как увел-е, так и умен-е их разм-в. В целом, различия в разм-х г-ма у р-й хорошо коррелируют с их эво-м происхождением. Дискретное строение г-мов: у орг-в, отн-хся к одному роду, изм-ся дискретным образом не размер min г-ма путем его последовательных удвоений, а значение С, хар-ное для г-ма с наименьшими размерами. Хар-но для р-й рода Tephrosia, нек-х беспозвоночных, у веслоногих. Дискретное правило выполняется не всегда.

Внутривидовые разл-я в разм-х г-ма.

Выс.видовая стабильность разм.г-ма, по-видимому, явл-ся общим правилом. Иссл-е разм. г-ма в популяциях лука Allium cepa на 4 континентах выявили его замечательную стабильность. Внутривидовые разл-я в сод.г-мной ДНК особ.хар-ны для г-ма р-й, к-е постоянно меняются. Сравнение Iчной структуры участков г-ма у кукурузы выявили отсутствие сходства более чем в 50% секв-х НП. Внутригеномное содержание мобильных генетических элементов может знач-но изм-ся у био-х видов и даже их локальных популяций. В частности, у кукурузы, москита и дрозофилы.

Такого рода данные вносят опр-е затруднения в исп-и разм.г-ма в кач.таксономического признака .
25. Фенотипические признаки эукариот, связанные с размером генома.

Некоторое число кол-х фенотипических признаков четко связано с разм.г-ма.



Размер кл-к и размер ядер. Сильная полож-я корреляция. Подтверждено для р-й и однокл-х эу. Объем кл-х ядер у ж-х и р-й также хорошо коррелирует с разм.г-ма, а, сл-но, и с объемом кл., обл-х данными ядрами. Явл.увел-я разм.кл.и всего орг-а у р-й-полиплоидов с ростом плоидности г-ма хор.известно. Объем кл.влияет на физиологические параметры орг., его приспособленность к среде обитания,т.е.на этот признак влияет эво.отбор. Причины корреляции понятны: эффективное выполнение кл-ми своих ф-ций требует опр-го потока мРНК, экспортируемой в ц-плазму ч/з ядерные поровые комплексы, кол.к-х зависит от разм.поверхности ядра.

Продолжительность кл-го цикла. Четкая положительная корреляция. Возрастание разм.г-ма приводит к увел-ю времени репликации ДНК в S-фазе, сопровождается увел-м продолж-сти G1-фазы. Соотношение м/у разм.г-ма и продолж-ть мейоза явл-ся более сложным. Для ж-х хар-на большая продолж-ть мейоза, чем для р-й с эквивалентным разм. г-ма, у млекопитающих мейотическое дел.кл.происходит дольше, чем у амфибий и нас.

Скорость роста и min время генерации. Отриц.зависимость c относ.скоростью роста. Полож-я с временем их генерации (дни до цветения или возраст нач.цветения или плодоношения). Эти факты нах-ся в соответствии с распространенностью р-й: виды, к-е растут быстро и воспроизводятся в более короткие промежутки времени, имеют больше шансов к распространению.

Кол-е признаки на ур.ор-в и тк-й. Семена крупнее у р-й с бόльшим разм.г-ма. Отмечено для V. faba и для 1220 видов р-й. Отриц.корреляция с удельной площадью листа.

Морфологическая сложность и продолжительность эмбрионального разв. у амфибий. Морф-ая сложность отд-х уч-в мозга саламандр, у к-х мозг устроен проще, чем у лягушек, коррелирует с разм.кл.мозга. Лягушки с небольшим разм.кл.и меньшим г-мом обладают более сложно устроенным мозгом. Положительная корреляция с продолжительностью эмбрион-го разв (саламандры).

Эво.и эко. Слабая отр-я зависимость м/у числом видов в роде и разм.г-ма. Возможно, р-я с большими г-мами менее изменчивы, им.меньший потенциал к видообразованию и больший риск вымирания в проц.эво. Виды р-й с небольшими г-мами встречаются во всех широтах и на высокогорье, тогда как растения с большими геномами избегают экстремальных усл.сущ-я.
26. Клиническая протеомика. Поиск белковых маркеров для диагностики и терапии социально – значимых заболеваний.

В настоящее время в медицине применение методов протеомного анализа позволяет выявить маркеры сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний на ранней стадии заболевания (клиническая протеомика).

Клиническая протеомика — идент-я и количеств опр-е всех индивидуальных белков, кот содержатся в биологическом образце (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, ткань) и мониторинг изменения их концентраций. Методы протеом анализа позволяют проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций, что позволяет проводить диагностику и мониторинг течения заболевания.

Ранние маркеры диагностики инфаркта миокарда (ИМ):

1. (h-FABP) – цитоплазматический протеин с окисленной жирной кислотой; появляется через 1,5-3 часа после события, специфичен для кардиальной мышцы.

2. Миоглобин(MYO) – «маленький» протеин, способный уменьшать кислород в тканях, появляется чрез 2-3 часа после события в сердце.

3. Тропонин является белком, выделяющимся из кардиомиоцитов при некрозе миокарда. Уровень в крови зависит от размера инфаркта-возможность оценить прогноз жизни больного в последующем периоде.

4. Копептин. Является производным аргининового вазопрессина, воздейств на осморегуляцию и сердечно-сосудистый гомеостаз, после ОИМ вазопрессин усиливает периферическую вазоконстрикцию-увелич постнагрузка и напряжение стенки желудочков; повышает синтез белка в клетках, что приводит к гипертрофии левого желудочка и приводит к сужению коронарных артерий. С помощью копептина можно исключить ОИМ в раннем периоде, является хорошим маркером нейрогормонального стресса и он полезен также при стратификации риска при сепсисе.

5.Белок-связывающие жирные кислоты кардиального типа (БСЖК). Низкая мол м, участвуют в метаболизме ЖКв кардиомиоцитах. Уровень БСЖК в крови резко повышается в крови при ИМ, является ранним маркером ишемии (в предынфарктном периоде).

6. Креатинкиназа-МБ (creatine kinase-muscle brain) – стабильный маркер диагностики ИМ, появляется через 4-6 часов, специфичен для сердца.

5. РАРР-А - маркер атеросклероза и предиктор сердечно-сосудистого риска.

Опухолевые маркеры (онкомаркеры).Маркеры опухолевого роста можно подразделить на: 1)иммунологические - ассоциированные с опухолью антигены или антитела к ним;2)гормоны - (ХГЧ, адренокортикотропный гормон);3)ферменты - фосфатазы, лактатдегидрогеназы и др.;4)продукты обмена - креатин, гидроксипролин, полиамины, свободная ДНК;5)белки плазмы - ферритин, церулоплазмин, β2-микроглобулин;6)белковые продукты распада опухолей.

Диагностика опухолей основана на использовании ассоциированных с опухолью онкомаркеров-явл макромолек, чаще белки с углевод/липид компонентом. От соединений, продуцируемых нормальными клетками отличаются качественно (опухолеспецифичные) и количественно (ассоциированные с опухолью, но присутствующие также и в нормальных клетках), форм-ся внутри/на поверхности опух кл, или в результате индукции обр-ся в других клетках.



1. Опухоли яичников. Исп онкофетальные антигены (альфа-фетопротеин и хорионический гонадотропин) и опухоль-ассоциированные антигены (СА125, СА19-9).

2. Рак шейки матки. Специф тканевой полипептид (Tissue Polypeptide Specific antigen, TPS) и раковоэмбриональный антиген (РЭА).

3. Рак молочной железы. СА15-3 – маркер и группа онкофетальных антигенов - раковоэмбриональный антиген (РЭА), тканевый полипептидный антиген (ТРА), ферритин, β2-микроглобулин. Онкофетальные антигены не являются специф к опух кл – исп для оценки и ранней диагностики отдаленных метастазов.

4. Онкоурология. Опухолевый маркер UBC (Urinary Bladder Cancer).

5. Рак ЖКТ. Серологический маркер СА242, также СА19-9 или РЭА.

6. Опухоли легких. ProGRP (предшественник гастрин релизинг пептида) и NSE (нейронспецифическая енолаза). NSE - это фермент, который является хорошим маркером всех нейроэндокринных опухолей.

7. БМ для диагностики глиомы (тип злокач опух гол мозга) ELTD1— допол БМ для глиом в доклинической и клинической диагностике опухолей.

Другие биомаркеры. Плазменный белок А (ПБА). ПБА является проатеросклеротической металлопротеиназой, которая значительно экспрессируется в нестабильных бляшках и их экстраклеточных матрицах и не увеличен в стабильных.
27. Биотехнологические основы разделения протеомов.

Протеом чел-й кл.чрезвычайно сложен и сод.до 100 тыс. разл.белков, кол-е сод.к-х может разл-ся на 4—5 порядков. В отл. от н/к кислот белки невозможно амплифицировать с пом.простых методов, таких как ПЦР, поскольку хим-ая и физ-я структуры белков чрезвычайно разнообразны. Поэтому основные методы экспрессионной протеомики базируются на разделении сл.смесей и идентификации белков в индивидуальных фракциях масс-спектрометрией. В настоящее время наиболее популярный метод разделения — двумерный электрофорез (2DGE). Поскольку протеом оч.сложен, то проц. осн-й только на одном св-ве (размер, величина заряда, растворимость), не способен обеспечить необходимое разрешение. Преимущества 2D электрофореза закл-ся в том, что белки разделяются в одном напр.по заряду, а в др.напр.по массе . Разделение по заряду достигается изоэлектрической фокусировкой, при к-й денатурированные белки разделяются на полоске геля, имеющего градиент рН. Под действием электрического поля бел­ки мигрируют в те обл.геля, где значения pH соответствуют обще­му заряду белковых молекул. Электрофорез ведут в течение долгого времени, так что белки фокусируются в участках, соответствующих изоэлектрическим точкам, независимо от разм.белков. Полоска геля затем уравновешивается в р-ре детергента додецилсульфата натрия, к-й им.большой отр.заряд и связывается с остовом денатурированных белков стехиометрически, эффективно нейтрализуя заряд любой белковой мол. Полоску геля помещают на один край пластинки с гелем, и проводят электро­форез т.о., что эл-кое поле направлено перпендику­лярно полоске. Разделение по разм.достигается с пом.стан­д-го ДСН-ПААГ, в к-м белки движутся к аноду по порам геля, при этом белковые мол.меньшего размера движутся сквозь поры быстрее, чем большие белки. Затем гель обычно прокрашивается, и белки обнаруживаются в виде набора пятен. Из-за нек-х ограничений метода 2D (в частности, низкая чувствительность в отношении белков, сод-ся в смеси в оч.малых кол-х, низкая репрезентативность опр.классов белков, включая мембранные белки) все боль­шую популярность в кач.альтернативного метода разделения при­обретает многомерная хроматография. Методы, осн-е на распреде­лении смеси белков м/у твердой неподвижной фазой и жидкой под­вижной фазой, наз-ся хроматографическими. Неподвижная фаза (или матрикс, носитель) обычно нах-ся в колонке, а подвижная фаза протекает через нее. В протеомике наиболее применяемый ме­тод — высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), при к-й жидкая фаза проходит ч/з колонку под выс.давлением. Одно из главных преим.ВЭЖХ, помимо скорости и чувствитель­ности, — это возможность ее автоматизации и объединения с после­дующим масс-спектрометрическим анализом.



Белковые пятна на двумерном геле или фракции, элюируемые с ВЭЖХ-колонок, сод. неизвестные («безымянные») белки. До недав­него времени для их идентификации использовали либо агент, специфи­чески связывающийся с белком (обычно, антитело), либо секвени­рование белка ступенчатой деградацией по Эдману. Но они не подходят для анализа целого протеома, когда необходимо быстро охар-ть тысячи белков. Быстрая идентификация белков м.б.достигнута масс-спектрометрически. Масс-спектрометрия (МС) исп-ся для опр.мол-х масс. В ре­з.разработки методов мягкой ионизации, таких как матрично­активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ, или англ. MALDI, т. е. лазерная десорбция при содействии матрицы) и электро­спрей-ионизация (ЭСИ, или англ. ESI), появилась возможность опр-ть массы больших мол.


28. Белковые чипы.

Биочип – это небольшая (от нескольких миллиметров) пластинка из стекла, пластика или кремния, вмещающая до нескольких десятков тысяч упорядоченно нанесенных микротестов на основе ДНК или белков для проведения множественного биохим-го анализа. Вкупе с прибором - анализатором это мини-лаборатория, помогающая быстро получать самые точные рез-ты. Сущ-ют 3 осн-х типа биочипов: ДНК-чипы, белковые и клеточные чипы.

Для анализа продуктов трансляции генов исп-ют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лек-ных мишеней яв-ся белками, след-но, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в кач-ве миниатюрных аналитических с-м для опр-ния иммунного статуса орг-ма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. Микрочипы, представляющие собрание осн-х антигенов главных патогенных орг-в (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции. Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов – РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с исп-нием флуоресцентных меток – ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в кот-м меткой яв-ся молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В кач-ве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.). Преимуществом ИФА яв-ся возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные с-мы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, н-р, ELF-97. Процесс изготовления белкового микрочипа должен вкл-ть процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода опр-ся многими параметрами - природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно прим-ся для анализа всех известных и доступных биол-х жидкостей, вкл-я сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость.

Белковые микрочипы — это миниатюр­ные приспособления, анало­гичные ДНК-микрочипам и исп-мые для анализа белков. Они и производятся практически так же — путем автоматиче­ского точечного нанесения белковых об­разцов на обработанные стеклянные под­ложки. Сущ-ет 2 осн-х типа чи­пов аналитические чипы и функциональные чипы. Функц-ные чипы исп-ся для исслед-я биохим-й акт-ти и взаимодействия бел­ков, при этом сами исследуемые белки иммобилизованы на чипе. Аналитические чипы исп-ся для мони­торинга экспрессии, и исследуемые белки нах-ся в образце, кот-м обрабаты­вают чип. Чип сам по себе содержит спе­цифические улавливающие агенты, ко­т-е могут представлять собой белки (н-р, антитела, лектины) или моле­кулы другого типа (н-р, олигонуклеотидные аптамеры). Сущ-ют также другие типы аналитических уст-в, называе­мых белковыми биочипами. Они не улавливают специфические белки, а со­держит на поверхности различные хим-кие в-ва, кот-е связывают опре­деленные классы белков.



Белковые микрочипы имеют те же пре­имущества, что и ДНК-чипы, т. е. они по­зволяют одновременно проводить парал­лельный анализ множества белков в мик­ромасштабе и в автоматизированном ва­рианте. Их можно легко объединить с по­следующим масс-спектрометрическим анализом, и они пригодны для исп-ния новых методов детекции, таких как спектроскопия поверхностного плаз­менного резонанса, а это значит, что нет необходимости вводить в белок мет­ку. Возможный недостаток заключается в том, что белки хим-ки чрезвычайно разнообразны, и трудно подобрать уни­версальный набор ус-й при исп-нии чипов, кот-е бы подходили для всех белков. Тем не менее недавно был создан функц-ный чип, несущий большую часть всех (около 6000) дрож­жевых белков, что должно существенно продвинуть анализ дрожжевого протеома. Протеом человека на порядок слож­нее, чем дрожжевой протеом из-за аль­тернативного сплайсинга и посттрансля­ционной модификации, так что малове­роятно, что чип с человеческим протеомом появится в ближайшем будущем.
29. Геномика и этика.

Геномика - раздел мол.ген., посвящ. изуч. генома и генов жив.орг-в. В её прикладном разделе учёные всего мира, а также частные компании зан-ся прим-ем плодов изуч.генома чел.: в генной терапии и диагностике, пренатальной диагностике, а в перспективе будущего – изм-е старых св-в (наслед-х заб-й и недостатков) или привнесение новых св-в в орг-м, модификация. Этика - это набор моральных принципов и ценностей, управляющий поведением чел. или гр.людей и опред-щий «+» и «-» оценки их мыслей и действий. Начиная с середины прошлого столетия темпы развития генетики постепенно ускоряются, происходят грандиозные открытия как в теории, так и в прикладной генетике. С завершением программы «Геном Человека» стало возможным картирование чел-го генома, т.е. создание, своего рода схемы расположения генов отдельно взятого человека, что позволяет локализовать причины многих врождённых и полученных пороков, болезней и т.д. Лечение на генном у-не, в перспективе, позволяет бороться не со следствиями болезней, а с их первопричинами, что в идеале и яв-ся целью медицины в целом. Но современных научных знаний не хватает для осущ-ния манипуляций такого у-ня, даже при успешной локализации, не придумано способа, позв-го вырезать точно опред-й неустраивающий ген или только один н-д и встроить на его место новый. Даже если это и удастся in vitro, тоже надо провести и in vivo, причём не в одной кл., а в сов-ти всех кл-к орг-ма, т.е. во многих миллиардах кл-к. Чел-во стоит на пороге великих возможностей. И только от моральных качеств исслед-й зависит дальнейшая судьба чел-ва, поэтому и была призвана этика, для опр-я допустимых и недопустимых шагов по направлению к будущему. Известно, что главные опасности генной терапии связаны с вирусной природой носителя трансгена. Такой вирус не должен заражать др.людей и не должен инфицировать половые клетки пациента, чтобы не передать трансген потомству и сделать его трансгенным. Однако считается, что в настоящее время технологии генной терапии, при их разумном выборе, не несут пациентам опасности, выходящей за рамки обычных мед.процедур. В наст. время генная инженерия технически несовершенна, т.к. она не в состоянии управлять процессом встраивания нового гена. Поэтому невозможно предвидеть место встраивания и эффекты добавленного гена. Даже в том случае, если местоположение гена окажется возможным уст-ть после его встраивания в геном, имеющиеся сведения о ДНК очень неполны для того, чтобы предсказать рез-ты. Моральное обязательство Всеобщая декларация о геноме человека и о правах человека, единогласно и путем аккламации принятая Генеральной конференцией ЮНЕСКО на ее 29-й сессии 11 ноября 1997 г., стала первым всеобщим правовым актом в области биологии. Геном чел. лежит в основе изначальной общности всех представителей чел-го рода, а также признания их неотъемлемого достоинства и разнообразия. Геном человека знаменует собой достояние чел-ва. Каждый человек им. право на уважение его достоинства и его прав, вне зав-ти от его ген-ких хар-к. Такое достоинство непреложно означает, что личность чел. не может сводиться к его ген-ким хар-кам, и требует уважения его уникальности и неповторимости. Геном чел. в силу его эволюционного хар-ра подвержен мутациям. Он содержит в себе возм-ти, кот-е проявляются различным образом в зав-ти от природной и социальной среды каждого чел., в частности состояния здоровья, ус-й жизни, питания и обр-ния. Геном чел. в его естественном сост. не должен служить источником извлечения доходов. Исслед-я, лечение или диагностика, связанные с геномом какого-либо чел., могут проводиться лишь после тщательной предварительной оценки связанных с ними потенциальных опасностей и преимуществ и с учетом всех др. предписаний, уст-ных нац-ным законодательством. Должно соблюдаться право каждого чел. решать быть или не быть информированным о рез-тах ген-го анализа и его последствиях. По признаку ген-х хар-к никто не может подвергаться дискриминации, цели или рез-ты кот-й представляют собой посягательство на права чел., основные свободы и чел-кое достоинство. Конфиденциальность ген-х данных, кот-е касаются чел., чья личность м.б. уст-на, и кот-е хранятся или подвергаются обработке в научных или любых др. целях, должна охраняться в соответствии с законом. Каждый чел. в соотв. с международным правом и нац-ным законодательством имеет право на справедливую компенсацию того или иного ущерба, причиненного в рез-те непосредственного и детерминирующего воздействия на его геном. Никакие исслед-я, касающиеся генома чел., равно как и никакие прикладные исслед-я в этой области, особенно в сферах биологии, генетики и медицины, не должны превалировать над уважением прав чел., осн-х свобод и чел-го достоинства отдельных людей или, в соответствующих случаях, гр. людей. Не допускается практика, противоречащая чел-му достоинству, такая, как практика клонирования в целях воспроизводства чел-кой особи, генома чел., при должном уважении достоинства и прав каждого чел. Свобода проведения научных исслед-й, кот-я необходима для развития знаний, яв-ся составной частью свободы мысли. Цель прикладного исп-ния рез-тов научных исслед-й, касающихся генома чел., особенно в области биологии, генетики и медицины, закл-ся в ум-нии страданий людей и в улучшении состояния здоровья каждого чел. и всего чел-ва. Любая форма дискриминации в отношении лица по признаку его ген-го наследия запрещается. Прогностические тесты на наличие генетического заболевания или на наличие генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию могут проводиться только в медицинских целях или в целях мед-кой науки и при условии надлежащей консультации специалиста - генетика. Вмешательство в геном чел., направленное на его модификацию, м.б. осущ-но лишь в профилактических, диагностических или терапевтических целях и только при ус-и, что оно не направлено на изм-е генома наследников данного чел. Не допускается исп-ние вспомогательный медицинских технологий деторождения в целях выбора пола будущего ребенка, за исключением случаев, когда это делается с тем, чтобы предотвратить наследование будущим ребенком заб-я, связанного с полом.
30.Онкогеномика и молекулярная диагностика в онкологии

Молекулярно-генетические тесты являются более быстрыми и точными они позволяют обнаружить минимальную резидуальную болезнь, поскольку клоновые маркеры раковых клеток, типа хромосомных транслокаций и реарранжеровок генов могут быть определены на уровне единственной на миллион раковой клетки. 1. Предрасположенность к раку. Ряд генов, (RB, p53, APC, WTI, NFI) обладают способностью переносить наследуемые мутации. Эти мутации обычно присутствуют во всех тканях и клетках тела и предрасполагают индивидуума к раку.   2.      Амплификация специфических генов. В норме клетки содержат 2 копии (аллеля) каждого гена. Однако раковые клетки часто теряют некоторые гены и/или амплифицируют другие гены. При некоторых раках (например, N-myc при нейробластоме и HER/2 при раке молочной железы) увеличение количества копий (обычно обозначаемых как число копий гена) и/или усиленная транскрипция или экспрессия нескольких генов связана с плохим прогнозом.  3.      Маркеры клональности. Большинство опухолей является клональными, поскольку они развиваются из единственной клетки, и поэтому все опухолевые клетки содержат одни и те же генетические нарушения. Любой молекулярный диагностический маркер может рассматриваться как маркер клональности. Однако не все молекулярные изменения, обнаруженные в раковых клетках, будут обязательно выявляться в каждой клетке опухоли.   4.      ДНК анализ для трансплантации. Используя молекулярные зонды и другие полиморфные маркеры, может быть получена пептидная карта (фингерпринт). Различие между генетическим маркером и геном. Генетический маркер не несёт никакой биологической функции. Ген может нести вызывающую рак мутацию, но генетический маркер позволяет идентифицировать повреждающую мутацию или ген. Одно из важнейших направлений в медицинской геномике — онкогеномика — направление науки, изучающее молекулярно-генетические механизмы злокачественного перерождения клеток. В настоящее время сформировалось несколько направлений использования молекулярных тестов в онкологии: 1) Раннее выявление опухолей наиболее часто основывается на определении мутаций ras и p53, обнаружение которых позволяет в некоторых случаях судить о стадии опухолевого процесса. Информативным ранним маркером рака толстой кишки служат мутации гена АРС, обнаруживаемые более чем в 70% аденом. Микросателлитные маркеры высоко эффективны в ранней диагностике рака мочевого пузыря и простаты. Широкий спектр опухолей может быть диагностирован с использованием протоколов активности телоизомеразы. 2) Метастазирование и распространенность опухоли также могут оцениваться с применением молекулярных тестов. Наиболее часто для этих целей используют RT-PCR метод выявления изменений экспрессии генов в опухолевых клетках. 3) Анализ цитологических и гистологических препаратов с помощью молекулярных тестов находит все более широкое применение. Примером может служить определение HPV вирусов при раке шейки матки, а также применение молекулярных тестов для выявления мутаций онкогенов непосредственно на гистологических срезах. 4) Промежуточные биомаркеры служат для выявления клональных и генетических изменений, позволяющих предсказать появление опухолей. 5) Генетическое тестирование онкологического риска стало возможным в связи с открытием генов предрасположенности к онкологическим заболеваниям, что оказалось особенно актуальным для оценки риска среди членов так называемых "высокораковых" семей.
31. Этногеномика. Полиморфизм ДНК и его использование для изучения истории и происхождения народов.

Ген-кие карты чел. Осн-тся на анализе полиморфизмов послед-тей ДНК у существующих семейных родословных. Послед-ти геномов 2 неродственных индивидов идентичны на 99. 9%. Различия в 0.1% всего генома представляют наибольший интерес, поскольку каждого из нас делают уникальным.

Ген-кие мутации, кот-е вызывают наслед-е заб-я, очень редки и составляют небольшую долю вариаций. Подавляющее их большинство сущ-ет в форме полиморфизмов послед-тей ДНК, где несколько различных вариантов аллелей могут быть весьма распространенными. Эти вариации исп-ся в кач-ве маркеров для создания ген-х карт, поскольку аллели можно обнаружить и идентифицировать гибридизацией или ПЦР – анализом и, т.о., утанавливать происходила ли рекомбинация в семейной родословной.

Около 95% полиморфных послед-тей представлено однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП), т.е. позициями единичных н-дов, кот-е у одних людей могут быть заняты одним осн-ем, а у др.-альтернативным. Если ОНП расположены вблизи или внутри генов, то они могут иметь явный фенотипический эффект (н-р полим-м. влияющий на цвет волос). Однако в большинстве случаев ОНП могут влиять на предрасположенность к заб-ям. Некоторые РНП вызывают появление или исчезновение сайтов рестрикции.



Осн-й инструмент этногеномики.

Для исслед-й геномов людей исп-ют разные типы ДНК-маркеров: расположенные на парных хр-мах (аутосомные), на мт ДНК и на непарной Y-хромосоме. Маркеры на парных хр-мах наследуются по обеим - женской и мужской - линиям, в них представлена подавляющая часть генома чел.

Исп-я опред-е типы полим-ма ДНК, можно оценить те или иные временные события, происходившие в истории данной популяции.

Особую роль играют маркеры мт ДНК и ДНК Y-хромосомы, поскольку они помогают проследить ген-кую историю чел-ва отдельно по жен. и муж. линиям. Мт ДНК передается потомкам только от матери, так как митохондрии находятся в цитоплазме клетки, а цитоплазма потомка (зиготы) обр-ся за счет цитоплазмы материнской яйцеклетки. Если два чел. имеют общего предка жен. пола, то по различиям их мтДНК можно судить о том, сколько поколений отделяет их от жившей столетия или тысячелетия назад общей пра-... прабабушки. Аналогично изучение ДНК Y-хромосомы позволяет проследить эволюционные траектории по отцовской линии, поскольку Y-хромосома передается только от отца к сыну. Оба типа полим-ма ДНК дополняют друг друга, давая раздельную инф-цию об отцовском и материнском вкладе в этническую историю и эволюцию популяций.

У-нь разнообразия геномов представителей биол-го вида зависит от разнообразия геномов прародителей вида и от скорости накопления случайных "ошибок" (мутаций) и еще от того, как долго сущ-ет данный вид. При сравнении ген-х текстов Y-хр-мы (или мтДНК) разных людей по присутствию в них одинаковых мутаций можно выявить общего предка.

Согласно современным представлениям, скорость накопления мутаций в ДНК относительно постоянна, большинство мутаций не затрагивают смысловые участки генома. Сравнивая два родственных ген-х текста, по кол-ву различий м\у ними можно уст-ть время появления как мутаций, так и общего предка по муж. или жен. линиям.

Изучение полим-ма ДНК позволяет выявлять значительные внутри- и межпопуляционные различия в частотах полиморфных маркеров ДНК во многих районах мира, что стало одной из важнейших хар-к ген-кой стр-ры чел-ких сообществ. За последнее десятилетие генетиками собраны и проанализированы коллекции мтДНК и Y-xpoмосом представителей народов почти всего мира. По ним восстановлена послед-ть и время появления мутаций в ДНК чел.

ДНК-маркеры - эффективный инструмент для исслед-я гаплотипов - сочетаний аллелей тесно сцепленных полиморфных локусов. Аллель - одна из возможных альтернативных форм гена, а локус - область локализации гена в хр-ме или молекуле ДНК. Гаплотипы весьма невелики по размерам, поэтому очень редко рекомбинируют. Они ведут себя как единые блоки, мало меняющиеся во времени и поэтому имеющие довольно древнее происхождение. Т.о., размер сохранившегося неизменным гаплотипа может служить мерой времени, кот-е прошло от какого-то момента в прошлом.

В 80-90-х годах прошлого века шло интенсивное накопление знаний об изм-ти мтДНК человека, были описаны осн-е расовые и популяционно-специфические типы мтДНК. Глобальный скрининг всех осн-х расовых гр. чел-ва по полим-зму мт генома позволил выявить наиболее древние мутации - ключевые для опр-я расоспецифических кластеров. Мт геномы представлены комбинациями расовых гр. типов мтДНК, каждая из кот-х ведет происхождение от единственного основателя.

В общей сложности полим-мов на весь геном насчитывается примерно 4 млн. Около 2.5 млн полим-мов приходится на смысловую, кодирующую часть генома. Нередко эти замены приводят к изм-ям в стр-ре продуктов соотв-щих генов; соотв-но меняются и их функц-ные св-ва. Спектры ген-х полим-мов зависят от географических ус-вий, диеты, расовой (этнической) принадлежности и др. и возникают в рез-те естественного отбора. В опред-х ус-ях они могут предрасполагать к развитию специфических заб-ний или, напротив, препятствовать им.


32. Геном человека как научная основа предиктивной медицины.

Расшифровка генома человека привела к возникновению такого направления современной науки, как молекулярная медицина. В ее основе лежат представления о геноме человека, который отличается индивидуальностью. Предиктивная медицина - это одно из направлений современной молекулярной медицины, которая изучает возможность прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Возникла она раньше, чем был расшифрован геном человека, еще в 1977 г. Термин “предиктивная медицина” предложил французский ученый лауреат Нобелевской премии Дж.Доссэ. С расшифровкой всего генома возможности исследовать генные ассоциации различных заболеваний сильно возросли. Для каждого заболевания следует тестировать не все известные гены, а только те, которые контролируют продукты (белки, ферменты), непосредственно вовлеченные в тот или иной патологический процесс.Наиболее обширная группа генов, генная сеть, определена для сердечно-сосудистых заболеваний — около 200 генов. Генные сети других болезней менее многочисленны и содержат около 40—50 генов.

Участие разных генов в развитии любой патологии не одинаково. Практически для каждой болезни можно выделить главные гены, продукты которых играют ключевую роль в инициации патологического процесса, и второстепенные, чьи продукты играют дополнительную роль. При этом, гены, критичные для одного заболевания, для другого могут оказаться менее важными.

Мол.ДНК каждого человека уникальна. В ней имеется множество различных вариантов нуклеотидных последовательностей, характерных именно для данного индивидуума. Они особенно многочисленны на уровне случайных замен нуклеотидов. В общей сложности таких замен (полиморфизмов) на весь геном насчитывается примерно 4 млн. Около 2.5 млн полиморфизмов приходится на смысловую, кодирующую часть генома. Нередко эти замены приводят к изменениям в структуре продуктов соответствующих генов; соответственно меняются и их функциональные свойства. Спектры генетических полиморфизмов зависят от географических условий, диеты, расовой (этнической) принадлежности и др. и возникают в результате естественного отбора. В определенных условиях они могут предрасполагать к развитию специфических заболеваний или, напротив, препятствовать им. Наличие у человека неблагоприятных вариантов генов, приводящих к появлению функционально ослабленных генопродуктов (белков, ферментов), в конечном счете и лежит в основе наследственной предрасположенности человека к тому или иному недугу.

Т.о., гены предрасположенности — это варианты генов, совместимые с нормальным ходом онтогенеза, но на более поздних стадиях развития в неблагоприятных условиях они приводят к различным заболеваниям.

Изучение полиморфизмов генов предрасположенности - основа предиктивной медицины. Как показали многочисленные исследования, к генам предрасположенности часто относятся гены, контролирующие ферменты системы детоксикации, гены белков клеточных рецепторов и гены, играющие ключевую роль в различных жизненно важных метаболических циклах организма (так называемые гены метаболических “шунтов”).


33.Биотерроризм

Биотерроризм – это использование биологических агентов или токсинов для уничтожения человеческих, продовольственных (в том числе сельскохозяйственных), биологических, экологических ресурсов, или получение над ними внешнего контроля. В 1993г. Секта в Японии распылила споры сибирской язвы в Токио. В октябре 2001 г. 5 человек умерли и 12 инфицированы в результате присланных по почте спор сибирской язвы. В зависимости от уровня риска средства биологической войны разделены на 3 категории: А. Б, и В. Категория А. Могут распространяться и передаваться от человека к человеку. Могут быть причиной высокой смертности и потенциально представляют большую угрозу здоровью общества. Могут вызывать панику и беспорядки в обществе. Требуют спец. действий со стороны системы здравоохранения. Примеры: Bac.anthracis (сибирская язва), чума, натуральная оспа, вирусная геморрагическая лихорадка. Категория Б. Характеризуется умеренной скоростью распространения. Вызывает умеренный уровень заболеваемости и смертности. Требует увеличения возможностей диагностики и наблюдения на общенациональном уровне. Пример: Вирусный энцефалит, Род Brucella, Burkholderiamallei, pseudomallei. Категория В. Вновь появляющиеся патогены, способные оказать сильное влияние на систему здравоохранения. Могут быть искусственно переконструированы для массового заражения из-за доступности и легкости производства. Примеры: Хантавирусы, вирус Нипа. Бактериологическая война и биотерроризм – проблемы мультифакторные, поэтому требуют мультифакторных решений. Для противодействия геномным биотехнологиям используются те же методы, что и для производства биоагентов: Расшифровка генома человека. Новые биотехнологии позволят проанализировать весь каскад процессов, происходящих в клетке человека, в том числе и процесс инфицирования патогеном. Можно будет понять причины индивидуальной восприимчивости к инфекционным заболеваниям. Стимулирование иммунной системы. Расшифровка генома человека станет началом лучшего понимания функций и механизмов иммунитета, что в свою очередь, будет иметь огромный потенциал в деле защиты от возможной бактериологической угрозы. Раскрытие секретов генома вирусов и бактерий. Позволит объяснить механизмы формирования высокой вирулентности и лекарственной устойчивости микроорганизмов – как патогенных, так и непатогенных. Быстрое и точное определение биоагента, развитие технологий и оборудования для идентификации. Биотехнологии нуждаются в новом, качественном и полностью автоматизированном оборудовании для определения биоагентов как естественных, так и созданных искусственным путем. Создание новых вакцин. Вакцины стимулируют гуморальный иммунитет, выработку специфичных антител к тем или иным патогенам. Создание новых антибиотиков и новых противовирусных средств. Успехи в геномике микробов значительно продвинули исследования в области фармакологии, в частности, разработку новых видов антибиотиков и антимикробных средств. Наличие сведений о геноме того или иного патогенного микроорганизма дает возможность унифицировать лекарственное средство, придать ему свойства нейтрализовать пагубное воздействие ряда патогенов. Эти изыскания ведут к созданию антибиотиков и антимикробных средств широчайшего спектра действия.
34. Опишите метод геномной дактилоскопии.

В наст.время хорошо известно, что в некодирующих обл.г-ма присутствуют тандемные повторы. Они представляют собой посл-ти, состоящие из разл.кол.мономеров, к-е содержат от 1 и до неск.десятков н/дов. Эффективность исп.мини- и микросателлитных посл-й (маркеров) в ДНК-диагностике обусловлена относительно равномерным распределением их на хромосомах и большим разнообразием. Полиморфизм мини- и микросателлитных повторов настолько высок, что на хромосомах разного происхождения (мать/отец), как правило, эти участки сод.разное кол.мономеров, (т.е. отл-ся по длине), что позволяет разл.хромосомы при семейном анализе, прослеживая их передачу в поколениях, и при идентификации принадлежности био.образца (например, пострадавший/подозреваемый). Информативность таких многоаллельных маркеров значительно выше (ур.гетерозиготности достигает 70—90%), чем диаллельных (точковых замен), а характер расположения полос минисателитных ДНК на электрофореграмме («ДНК-отпечаток») индивидуален практически также как и отпечатки пальцев (вероятность идентичности двух индивидов в популяции составляет 10-5- 10-8), что позволило дать название методу - геномная дактилоскопия (genetics fingeprinting). «Классический» метод геномной дактилоскопии представляет собой гибридизацию по Саузерну фрагментов ДНК, полученных в рез.рестрикции и разделения в агарозном геле. В кач.зондов для гибридизации исп-ся минисателлитная ДНК с длиной мономера от 9 до 40 п.н. и кол.его повтора от 10 до 30. Для установления или опровержения идентичности исследуемых образцов ДНК необходима последовательная гибридизация с 4-5 радиоактивно мечеными зондами. После каждой гибридизации на радиоавтографе визуализируют и сравнивают между собой наборы различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитным последовательностям образцов ДНК. Недостаток метода: значительная продолжительность иссл. (от неск.недель до неск.месяцев) и необходимость достаточно большого кол.ДНК. В последние годы для обнаружения различных мини- и микросателлитных последовательностей стали исп.различные модификации полимеразной цепной реакции (мультиплексная ПЦР, ПЦР с использованием меченых нуклеотидов). На сегодняшний день наиб.эффективным (т.е. достоверным, не требующим большого кол.био.материала и достаточно быстрым) методом идентификации личности считается сравнительный электрофоретический анализ фрагментов ДНК, полученных в рез.мультиплексной ПЦР STR-посл-й - тримерных и тетрамерных коротких тандемных повторов. При установлении био.родства (диагностики отцовства) одна половина полос «ДНК-отпечатка» ребенка должна соответствовать таковым у отца, а другая — у матери.


35. Секвенирование по Сэнгеру. Результаты и ошибки сэнгеровского секвенирования.

Секвенирование – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. Все методы секвенирования устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.

Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При секвенировании по Сенгеру происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырёх дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. Результаты и ошибки сэнгеровского секвенирования

На выходе из сэнгеровского секвенатора получаются короткие участки ДНК, так называемые риды (reads). Для биоинформатики принципиальны две вещи: во-первых, какой длины получаются риды, во-вторых, какие в них могут быть ошибки и как часто. Сэнгеровские риды по этим критериям очень хороши: получаются риды длиной около тысячи нуклеотидов, причём качество начинает заметно падать только после 700-800 нуклеотидов. Сам процесс секвенирования по Сэнгеру, предопределяет и эффект падения качества и другой эффект – если в геноме встречается длинная последовательность из одной и той же буквы (…AAAAAAAA…), трудно бывает точно определить, какой она длины – все промежуточные массы попадут в одну и ту же пробирку, некоторые из них могут не встретиться, некоторые слиться друг с другом и т.д. Но всё же сэнгеровское секвенирование даёт отличные результаты с достаточно длинными ридами, которые потом относительно легко собирать.

Именно при помощи сэнгеровского секвенирования был впервые расшифрован геном человека.
36.Секвенаторы второго поколения: Illumina. Ошибки и показатели качества в секвенаторах второго поколения.

Современные секвенаторы – секв-ры второго поколения (SGS, second generation sequencing). В них участки ДНК многократно клонируются, но процесс чтения устроен не так, как у Сэнгера. Сущ-т много разных методов, но один из самых популярных на сегодня – секвенирование по методу Solexa, ныне Illumina. Процесс секвенирования Illumina происходит так. (1) Копии ДНК разрезаются в случайных местах на большое число небольших участков. (2) К каждому участку с двух сторон доб-ют спец-ые адаптеры – заранее известные небольшие послед-ти нк. (3) Получ-ая смесь помещается на специально подготовленную подложку, из которой в виде решётки «растут» участки ДНК, комплем-ые адаптерам. Т.о., они способны «привязать» снабжённые адаптерами участки ДНК к этим местам. Адаптеры также содержат праймеры, участки, к кот. может присоед-ся ДНК-полимераза, кот. осущ-ет репликацию ДНК.

(4) На шаге 3 разные участки ДНК случайным образом «присасываются» к разным местам в решётке. Теперь многократно клонир-ся каждый участок вокруг своего места, получая тем самым целые «кластеры». Этот процесс известен как bridge amplification, потому что ДНК привязывается к подложке сразу двумя концами. (5) Участки ДНК денатурируют (разрушают водородные связи) – в результате из узлов решётки на подложке «растут» разные участки ДНК, состоящие из одной нити. (6) Подложка помещается в р-р, содер-щий ДНК-полимеразу и спец-но помеченные нуклеотиды, кот. сразу же заканчивают процесс репликации. Они присоед-ся к ДНК, по одному к каждому участку. Соотв-но, к каждому участку присоед-ся та «буква», с комплементарной к кот. он начинается. (7) «Лишние» нуклеотиды смывают, а метки оставшихся считывают; в технологии Illumina это флуоресцентные метки, кот. можно заставить светиться разным цветом и сфотографировать. Именно на этом шаге и узнается, с какой буквы нач-ся каждый «кластер участков» ДНК. (8) После этого с уже связанных нуклеотидов химически «срезается» радикал, кот. мешал дальнейшей надстройке молекулы ДНК. В результате на каждом цикле прочит-ся одновременно большое число нуклеотидов из разных послед-тей. Но участки ДНК, кот. мы можем прочесть, оказ-ся короче, чем в случае секвенирования по Сэнгеру – риды Illumina обычно получаются длиной около 100 нуклеотидов. Ошибки и показатели качества. Ошибки происходят на фазе, когда нужно распознать помеченные нуклеотиды, т.е. понять, каким цветом и с какой силой светятся кластеры из многократно клонированных участков ДНК. Проблема в том, что из-за неидеальности остальных этапов процесса, кластеры никогда не светятся только одним цветом; это всегда смесь всех четырёх цветов с той или иной интенсивностью. Нужно выделить наиболее интенсивную компоненту и оценить, насколько вероятна ошибка в этой букве; эта задача называется base calling (распознавание нуклеотидов). В рез-те каждому нк каждого рида секвенатор ставит в соответствие вероятность того, что этот нк был распознан правильно. Эти вероятности тоже можно использовать при сборке, и секвенаторы выдают их вместе с собственно ридами.
37. Секвенирование лигированием.

К одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать (а). Синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырёх нуклеотидов — А, Т, G или С (б). После того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером (в). Этот момент фиксируют, идентифицируют зонд, удаляют с матрицы комплекс и повторяют всю процедуру.





Каталог: uploads
uploads -> Стоматология история открытий
uploads -> Санкт-Петербург Москва
uploads -> В интернатуру/ординатуру на конкурсной основе принимаются лица, имеющие высшее профессиональное образование
uploads -> Занятие №1 Эргономика в стоматологии. Ручные дентальные вращающиеся инструменты. Вспомогательные приспособления и средства для эстетической реставрации зубов, их назначение. Средства изоляции от ротовой жидкости
uploads -> Тема №1 Клинические и лабораторные этапы изготовления вкладок, виниров. Особенности одонтопрепарирования под вкладки, виниры. Моделирование вкладок, виниров из воска, пластмассы
uploads -> Дважды в день следует чистить зубы, межзубные промежутки, после чего полоскать ротовую полость с помощью ополаскивателя
uploads -> Профилактика кариеса и заболеваний десен
uploads -> Памятка после санации и/или после проведения профессиональной гигиены полости рта


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница