Экзаменационные вопросы по геномике и протеомике



Скачать 452,8 Kb.
страница4/4
Дата01.08.2018
Размер452,8 Kb.
ТипЭкзаменационные вопросы
1   2   3   4
38. Пиросеквенирование.

"Секвенирование путем синтеза" заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы. Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами (APS) и люциферином. Добавление одного из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезоксинуклеотид в цепочку. При этом высвобождается пирофосфат. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает "топливом" для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ, Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой. Невключенные нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом. Существуют некоторые ограничения в применения этого способа. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300-500 нуклеотидов, что короче, чем 800-1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера).


39. Метод ионного полупроводникового секвенирования (секвенатор Ion Torrent).

В технологии полупроводникового секвенирования нашел применение хорошо известный биохим. процесс: при встраивании нуклеотида с помощью полимеразы в растущую цепь ДНК происходит выделение иона водорода, что можно зафиксировать изменением напряжения pH-чувствительной поверхности. Основным компонентом систем яв-ся полупроводниковый микрочип, включ-ий миллионы ячеек — pH-чувствительных сенсоров. При секвен-ии в каждую такую ячейку попадает микросфера с иммобил-ми клонами секвенируемой ДНК. Послед-ное присоед-ие опред-ных нк к цепи ДНК с послед-им выделением иона водорода фиксируется сенсором в реальном времени. Секвенирование таким образом проводится параллельно на всех ячейках чипа, и за один запуск прибора возможно считывание десятков и сотен миллионов послед-тей нк с очень высокой точностью. Суть метода. Секвенатор компании Ion Torrent работает с использованием дешевых коммерчески доступных нк и способен распознавать протоны, высвобожд-ся при присоед-ии нк к синтезируемой нити ДНК. Микроскопические бусины, содерж. фрагменты ДНК, сначала помещают в 1,2 миллиона лунок диаметром 3,5 мкм, расположенных на чипе, после чего чип послед-но погружают в 4 р-ра с нк. Лунки промыв-ся после каждого р-ра. Если нк комплементарен неспаренному основанию на бусине, он присоед-ся к синтезируемой нити ДНК и высвобождает ион водорода, из-за чего в лунке изменяется pH. Возникает электрический сигнал, означающий, что основание в конкретной лунке яв-ся следующим нуклеотидом в послед-ти ДНК. Каждый шаг занимает менее 5 секунд, позволяя каждому чипу «прочитывать» около 25 миллионов азотистых оснований за один двухчасовой пробег. Такие приборы могут секвенировать сотни миллиардов пар азотистых оснований за один пробег, и в данный момент они яв-ся более подходящими для секвенирования целого генома человека. Чиповое секвенирование больше подходит для получения быстрых результатов в небольших проектах, таких как секвенирование бактериальных геномов или характеристика заболеваний с помощью секвенирования конкретных участков генома нескольких пациентов.


40. Конформационная подвижность пептидной цепи. Карта Рамачандрана.

Белковая глобула сост. из полипептидной цепи, кот-я опр-ным образом уложена и обр-ет уникальную пространственную стр-ру белка. Длины полипептидных цепей молекул белков находятся в диапазоне от нескольких десятков до тысяч звеньев. В пептидной цепи различают 2 типа степеней свободы. Первый - высокочастотные колебания длин жестких валентных связей и валентных углов. Второй обусловлен значительно более мягкими конформационными степенями свободы, связанными с вращениями вокруг одинарных связей. В пептидах конформационные степени свободы (двугранные или торсионные углы) имеют опр-ные обозначения. Каждый а\тный остаток, за исключением концевых, принимает участие в обр-нии 2-х пептидных связей (с предыдущим и последующим фрагментами). Поскольку вращение вокруг связи C—N затруднено, повороты возможны только вокруг связей N--Cα и Cα--C (2). Такие повороты изм-ся двугранными углами φ и ψ. Угол φ хар-ет поворот вокруг связи N---Cα, а следовательно, положение предшествующей пептидной связи; угол ψ хар-ет поворот вокруг связи Сα—С, т. е. положение последующей связи.

Опр-ный набор значений всех двугранных торсионных углов, отвечающий одному из локальных минимумов потенциальной энергии, задает конформацию молекулы. Переход из одной конф-ции в другую или конф-ный переход осущ-ся за счет поворотов вокруг одинарных хим-х связей с преодолением потенциальных барьеров,

Именно конф-ные степени свободы опр-ют упругие св-ва и гибкость полимерных цепей. Эти же степени свободы играют важнейшую роль в структурообразовании и функц-нии белков. Особенно наглядно роль конф-ной подвижности можно проследить на примере сворачивания полипептидной цепи в уникальную третичную стр-ру, соответствующую белковой глобуле, кот-й отвечает опр-ная конформация цепи. В водном р-ре при изм-и pH многие белки денатурируют - переходят из компактной глобулярной формы в форму рыхлого клубка, т.е. стр-ры с практически случайными конформациями звеньев. При обратном изм-и pH в течение десятков секунд происходит восст-ние строго опред-й третичной стр-ры белковой глобулы. Процессы денатурации и ренатурации происходят за счет конф-ных движений полипептидной цепи.

Динамическое поведение белковых глобул опред-ся их конкретной хим-й стр-рой, наличием у полипептидной цепи конф-ных степеней свободы, обусловленных относительно легким вращением атомных групп вокруг одинарных хим-х связей. Белковая глобула яв-ся весьма плотным обр-ем, ее сжимаемость ниже, чем у простых орг-х жидкостей. Вторичные стр-ры полипептидной цепи формируют каркас молекулы белка, сравнимый по упругим хар-кам с куском капрона. Боковые а\тные гр. формируют вокруг каркаса относительно подвижную жидкоподобную среду с эффективной вязкостью. Подобная стр-ра оказывается выгодной для организации стереоспецифичных хим-х р-ций, обеспечивающих функц-ние белков.

Для каждого конкретного а\тного остатка ввиду стерических ограничений разрешены только определенные комбинации углов вращения φ и ψ.



Конформационные карты (карты Рамачандрана) построены на основе модельных экспериментов с небольшими пептидами. Однако конф-ные параметры большинства а\тных остатков в белках также попадают в разрешенные области карты. Карта Рамачандрана позволяет с высокой степенью точности определить вторичную стр-ру белка. С помощью карты можно уст-ть, какие торсионные углы хар-ны для α-спиралей и для β-листов, для различных а\тных остатков

Длины валентных связей и значения валентных углов в полипептидных остовах одинаковы во всех белках. Общая форма молекулы белка опред-ся вращением атомных группировок вокруг валентных связей.

Для описания такого вращения исп-ся понятие торсионного угла (иногда его наз. двугранным углом).

Торсионный угол определен для системы из 4-х точек в пространстве. Пусть это точки A, B, C, D. Если спроектировать эти точки из пространства на плоскость, перпендикулярную прямой (BC) и посмотреть на эту плоскость со стороны точки B, тогда на плоскости мы увидим 3 точки: A' — проекцию точки A, B' — проекцию точек B и C, и D' — проекцию точки D. Торсионным углом системы {A,B,C,D} наз-ся угол м\у векторами B'D' и B'A'. Значения этого угла лежат между –180° и +180°. Угол м\у векторами u и v считается «+», если для совмещения их направлений первый из углов необходимо повернуть против часовой стрелки ("в «+» направлении").




Н-р, на рис. изображена система из 4-х атомов. Торсионный угол вращения вокруг связи B-C вычисляется так: построить плоскость, перпендикулярную связи В-С и определить угол, на кот-й необходимо повернуть проекцию C-D, чтобы совместить её с проекцией A-B.



Ниже показано, как принято приписывать знак торсионному углу, если смотреть на с-му в направлении связи BC .



41.Мотивы в белковых структурах. Классификация пространственных структур белков.

Мотив структуры – часто встречающийся в белках элемент пространственной структуры (a-спираль, b-шпилька, b-поворот). Регулярными наз-ся вторичные структуры, образ-ые а/к-ми остатками с одинаковой конформацией главной цепи (углы φ и ψ), при разнообразии конформаций боковых групп. К регулярным вторичным структурам относят спирали, кот. могут быть лево- и правозакрученными с разным периодом и шагом. Спиральные структуры в полипептидных цепях поддерж-ся внутримол-ми водородными связями. К спиральным структурам, кот. встреч-ся в белках, относятся: α-спираль, или спираль 413, - самая распространённая в белках вторичная структура. Данная спираль харак-ся плотными витками вокруг длинной оси молекулы, один виток составляет 3,6 а/к-ых остатка, и шаг спирали составляет 0,54 нм, спираль стабилизирована водородными связями между H и O пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена. Спираль построена из L- аминокислот. Хотя она может быть как лево-, так и правозакрученной, в белках преобладает правозакрученная. 310-спираль- очень «тугая» спираль, в сечении имеет форму треугольника, в белках встр-ся её правая форма, и то только в виде 1-2 витков. π-спираль, или спираль 516, - спираль с широкими витками, в результате в центре спирали остаётся пустое пространство. В белках встреч-ся редко, не более одного витка. β-листы (β-структура, складчатые слои)- несколько зигзагообразных полипеп. цепей, в кот. водородные связи образ-ся м/у удалёнными друг от друга (0,347 нм на а/к-ый остаток) в первичной структуре а/к-ами или разными цепями белка, а не близко расположенными, как имеет место в α-спирали. Полипептидные цепи в составе β-листов могут быть направлены N-концами в противоположные стороны (антипараллельная β-структура), в одну сторону (параллельная β-структура), также возможно сущ-ние смешанной β-структуры (состоит из параллельной и антипараллельной β-структуры). Для образования β-листов важны небольшие размеры боковых групп а/к-т, преоб-т глицин и аланин. Полипролиновая спираль- плотная левая спираль, кот. стабилизирована Ван-дер-Ваальсовыми взаимод. Такая структура форм-ся в полипеп. цепях богатых пролином, где формирование насыщенной системы водородных связей по этой причине невозможно. Нерегулярными называют стандартные вторичные структуры, а/к-ые остатки кот-х имеют разную конформацию главной цепи (углы φ и ψ). К нерегулярным вторичным структурам относят повороты - нерегулярные участки полипептидной цепи, кот. обесп-ют поворот её направления на 180°. Если участок, обеспеч-ий поворот, достаточно длинный, исп-ся термин петля. Полуповороты, или переходы,- нерегулярные участки полипеп. цепи, кот. обесп-ют поворот её направления на 90°. Мин. полуповорот состоит из 3 а/к-ых остатков. Наличие в белках α- спиралей и β- структур было положено в основу структурной классификации белков, в соответствии с кот. разл-ют белки типа α (содержащие только α- спирали), типа β (содержащие только β- спирали), а также белки α+β и α/β. Белки α+β содержат α- спирали и β- структуры, отчетливо разделенные в пространстве вдоль цепи. Белки α/β имеют более сложное строение с перемежающимися участками α- спиралей и β- структур (напоминающее сэндвич). К белкам типа α относят миоглобин, цитохром с, белок вируса табачной мозаики и инсулин; к белкам типа β-супероксиддисмутаза и конкавалин А, к белкам типа α+β-рибонуклеаза и карбоангидраза, к типу α/β- карбоксипептидаза и триозофосфатизомераза. По структурным признакам общепринято деление белков на две большие группы: простые белки, структура кот-х представлена только полипеп. цепью, сложные белки, кот. содержат небелковый компонент. Простые белки по растворимости и пространственному строению разделяют на глобулярные (альбумины, гистоны, протамины, проламины) и фибриллярные (коллагены, кератины, эластины).
42.Методы установления первичной структуры белков. Методы анализа первичных структур

Общий подход к определению аминокислотной последовательности включает следующие стадии: 1) осуществление частичного гидролиза белка ферментами или химическими реагентами; 2) выделение полученных пептидов; 3) определение аминокислотных последовательностей этих небольших фрагментов. Очень часто используется метод “пептидных карт”. Этот метод заключается в том, что смесь пептидов наносится в виде полоски на лист хроматографической бумаги или на пластинку с тонким слоем целлюлозы и подвергается двумерной хроматографии или двумерному электрофорезу. После “проявления“ пептидной карты образуется набор пятен с определенным взаимным расположением, характерный для данного белка. Вторым наиболее часто используемым методом разделения пептидов является ионообменная хроматография на катионитах Dowex («дауэкс»). Элюируются пептиды из колонки с помощью пиридинацетатного буфера с определенным (подобранным) значением рН и определенной концентрацией. Более сложная задача – разделить смеси “длинных” пептидов (более 20 аминокислотных остатков). Для предотвращения агрегации в растворы добавляются детергенты. В качестве основных методов разделения “длинных” пептидов используется гель-фильтрация (фракционирование пептидов по молекулярной массе на специальных биогелях), ионообменная хроматография на ионообменных целлюлозах, противоточное распределение (фенол–вода, бутанол–вода), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на носителях с обращенными фазами (силикагель с ковалентно присоединенными С8 или С18 углеводородными радикалами). Для установления аминокислотной последовательности пептидов и белков используется совокупность химических, ферментативных и физико-химических методов. Метод Эдмана (метод ступенчатой деструкции, 1950 г.) К аминогруппе Ν-концевой α-аминокислоты присоединяют фенилизотиоцианат (ФИТЦ), каждый цикл деградации включает в себя 3 стадии:1) образование фенилтиокарбамоилпептида (ФТК); 2) отщепление Ν-концевого остатка аминокислоты в виде тиазолинона; 3) изомеризация тиазолинона в фенилтиогидантоин (ФТГ) и идентификация его. Метод Сенджера (взаимодействие пептида с 2,4-динитрофторбензолом, 1945 г.) При реакции α-аминогруппы пептида или белка с 2,4-динитрофторбензолом получается динитрофенильное производное (ДНФ), желтого цвета. Это производное гидролизуется в кислой среде, пептидные связи разрываются и образуется ДНФ-производное Ν-концевой аминокислоты, которое затем экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии. Метод Акабори (метод гидразинолиза пептидов, 1952 г.) Пептид или белок нагреваются при 100–120 °С с безводным гидразином. Пептидные связи разрываются с образованием гидразидов аминокислот, а C-концевая кислота освобождается, ее можно выделить из смеси и идентифицировать. Метод имеет ограничения, т. к. ряд аминокислот разрушается, а ряд гидразидов очень лабилен и превращается в аминокислоты. Метод Грея и Хартли (дансильный метод, 1963 г.) Реакция дансилхлорида с непротонированной α-аминогруппой пептида или белка с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). После гидролиза в кислой среде освобождается Ν-концевая аминокислота, содержащая дансильный остаток. Идентификация ДНС-аминокислот УФ-спектроскопией, микротонкослойной хроматографией, сейчас – высокоэффективной жидкостной хроматографией.
43. Методы установления пространственной структуры: спектроскопия ЯМР и рентгеноструктурный анализ.

В определение пространственной структуры белка :• Экспериментальный подход:- Рентгеновская кристаллография, Спектроскопия ядерного магнитного резонанса,• Вычислительный подход:- Предсказание пространственной структуры белка на основе информации о его последовательности - нерешенная задача. Предсказание пространственной структуры белка: Ab initio - моделирование укладки “из первых принципов” – без использования дополнительной информации о структурах схожих белков. • Предсказание на основе гомологии - моделирование на основе известных структур схожих белков.• Тридинг - моделирование на основе слабой гомологии. Предсказание структуры на основе гомологии:• Выравнивание рассматриваемой последовательности с последовательностями белков с известной 3D структурой (обычно >30% сходства) , • Наложение моделируемой последовательности на известную структуру согласно выравниванию,• Локальное улучшение полученной пространственной структуры. Предсказание структуры ab initio • Функция потенциальной энергии,• Поиск в пространстве всевозможных конформаций,• Предсказание вторичной структуры:- Модель водного раствора, - Оценка попарного взаимодействия между аминокислотами,- Модель на основе “решетки”,- Молекулярная динамика,- Использование библиотек известных 3D фрагментов. Предсказание структуры с использованием решетки:• HP-модель (Hydrophobic-Polar) - рассматривает гидрофобные взаимодействия как наиболее важные.- Не существует эффективных алгоритмов,- Плохо отражает реальность. Тридинг (Threading) - предсказание структуры на основе слабой гомологии -• Главное отличие от моделирования по гомологии -поиск наилучшей структуры осуществляется с помощью

выравнивания последовательности со структурой, а не с последовательностью. При этом используется

специальным образом определенная весовая функция. Основные компоненты тридинга:• библиотека уникальных укладок (фолдов),• функция, определяющая вес выравнивания последовательности со структурой,• алгоритм нахождения наилучшего выравнивания. Методы предсказания вторичной структуры

• Статистические методы- Chou-Fasman, GOR,• Ближайшего соседа - NNSSP, SSPAL,• Нейронные сети

• PHD, Psi-Pred, J-Pred,• Метод опорных векторов,• Скрытые Марковские модели.

ЯМР-спектроскопия - спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса. Перед тем, как провести данные анализы структуры белков, их сначала необходима кристаллизовать. Образец вещества помещается в тонкостенную стеклянную трубку. Когда ее помещают в магнитное поле, ЯМР активные ядра поглощают электромагнитную энергию. Смещение преобразуется в независимую от магнитного поля безразмерную величину известную как химический сдвиг. Частотный сдвиг экстремально мал в сравнении с основной ЯМР частотой. Так как химический сдвиг зависит от химического строения вещества, он применяется для получения структурной информации о молекулах в образце. Наиболее полезную информацию для определения структуры в одномерном ЯМР-спектре даёт так называемое спин-спиновое взаимодействие между активными ЯМР ядрами. Это взаимодействие возникает в результате переходов между различными спиновыми состояниями ядер в химических молекулах, что приводит к расщеплению сигналов ЯМР. Общей задачей является получение 3-мерной структуры белка в высоком разрешении, подобно изображениям получаемым в рентгеновской кристаллографии. Рентгеноструктурного анализа кристаллов органических веществ основан на том, что всякое вещество обладает способностью рассеивать падающее на него излучение, в том числе рентгеновское. При падении на кристалл рентгеновских лучей в некоторых направлениях возникают очень интенсивные рассеянные лучи.Фотоснимок картины рентгеновского рассеяния, состоит из отдельных пятен разной степени почернения. Измеряя расстояния между пятнами рентгенограммы, можно определить массу молекулы, ее симметрию, сделать предсказания формы молекулы. Измерив интенсивность пятен, можно определить
44. Классификация хроматографических методов. Материалы матриц сорбентов и обменников. Техника колоночной хроматографии.

Хроматография — метод разделения смесей веществ или частиц основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Составляющие хроматографии:

Колонка — содержит хроматографический сорбент, выполняет функцию разделения смеси на индивидуальные компоненты.

Элюент — подвижная фаза: газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид.

Неподвижная фаза — твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, в адсорбционной хроматографии — сорбент.

Хроматограмма — результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.

Хроматограф — прибор для проведения хроматографии.

КЛАССИФИКАЦИЯ

По агрегатному состоянию фаз:

Газовая хроматография(п.ф-газ)

Газо-жидкостная хроматография(н.ф.-жидкость)

Газо-твёрдофазная хроматография(н.ф.-твердая)

Жидкостная хроматография (п.ф.-жидкая)

Жидкостно-жидкостная хроматография(н.ф.-жидкость)

Жидкостно-твёрдофазная хроматография(н.ф.-твердая)

Жидкостно-гелевая хроматография(н.ф.-гель)

По механизму взаимодействия:

1)Распределительная хроматография(разделение основано на различии в растворимости сорбатов в п.ф. и н.ф.)

2)Ионообменная хроматография(задержание молекул в-ва в н.ф. обусловлено их связыванием с поверхностью гранул)

3)Адсорбционная хроматография(разделение за счет адсорбции основано на различии адсобируемости компонентов смеси на данном адсорбенте.

4)Аффинная хроматография(основана на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом)

5)Осадочная хроматография(разделение основано на различной растворимости осадков в п.ф.)

6)Гель-фильтрация(молекулы фракционируемых в-в не должны обладать никаким специальным срод­ством к н.ф. или п.ф.. Н.ф. представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул)

По цели проведения:

1.Аналитическая хроматография -предназначена для определения качественного и количественного состава исследуемой смеси.

2.Препаративная хроматография- применяется для выделения небольших количеств чистых компонентов (или смесей) в лабораторных условиях.

3.Промышленная хроматография- используется для получения чистых веществ в значительных количествах.

По способу ввода пробы:

Элюентная хроматография (проявительная)

Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса. В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.

Фронтальная хроматография

Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).

Вытеснительная хроматография

В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ.

Матрицей называют твердую основу неподвижной хроматографической фазы. Она имеет вид сплошных или пористых гранул; последние часто представляют собой пространственную сетку линейных полимеров. Для придания материалу матрицы необходимых для хроматографии свойств его модифицируют. Модификация может представлять собой химическое присоединение («присадку») поногенных групп, гидрофобных молекул, биологически активных веществ или фиксацию путем адсорбции тонкого слоя растворителя.

Колоночная хроматография — осуществляется пропусканием исследуемого раствора, содержащего несколько растворенных веществ, через стеклянную трубку (колонку), заполненную сорбентом. Вследствие неодинаковой поглощаемости (сорбируемости) различных веществ происходит их разделение. Чем лучше поглощается вещество, тем в более высоких частях колонки оно задерживается. Полученный таким образом слой сорбента с различно окрашенными зонами называют хроматограммой. Вещества, сорбированные на колонке, могут быть последовательно вытеснены (вымыты) и собраны по фракциям. Этот процесс называют элюцией.

Колоночная хроматография представляет собой простейший вариант адсорбционной хроматографии. Она используется для разделения смесей твердых веществ.

В качестве стационарной фазы используется какой-либо твердый адсорбент, например глинозем (оксид алюминия), а в качестве подвижной фазы-какой-либо растворитель. Стеклянную колонку сначала наполняют взвесью этих двух фаз. На дно колонки кладут прокладку из стекловаты, чтобы предотвратить вытекание взвеси. После того как взвесь осядет, растворитель выпускают из колонки до тех пор, пока его уровень не окажется чуть выше уровня твердой фазы. Процесс пропускания растворителя через колонку называется элюированием. Разделение различных компонентов смеси происходит по мере постепенного перемещения вдоль колонки.
45. Физико- химические методы современных электрофоретических методов разделения белков. Программное обеспечение для анализа двумерных электрофореграмм

Электрофор-е разделение белков основано на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, величиной рН и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна их размеру и степени гидратации. Виды электрофореза. В настоящее время разработано большое число электрофоретических методов, которые базируются на свойствах белков и особенностях их взаимодействия с поддерживающей средой, применяемой при электрофорезе.



I.В зависимости от агрегатного состояния среды, применяемой при проведении электрофореза, различают: фронтальный (жидкостный) электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде; зональный электрофорез, при котором фракционирование происходит на закрепленной среде (на опорном материале или носителе), выполняющих роль стабилизатора образующихся фракций. II. По способу нанесения образца электрофоретические методы делят на 3 вида. 1. Электрофорез с подвижной границей, осуществляемый в свободной (незакрепленной) среде: разделяемые макромолекулы присутствуют во всем объеме раствора. 2. Зональный электрофорез - исследуемый раствор наносят в виде пятна или полосы на поддерживающий носитель. 3. Метод электрофореза в свободном потоке (непрерывный электрофорез): разделяемая смесь непрерывно подается в протекающий слой буфера. III. По принципу фракционирования выделяют следующие группы: 1. Электрофорез в среде с постоянным значением рН: разделение базируется на различиях и величине заряда компонентов смеси при данном значении рН. 2. Изоэлектрическое фокусирование: разделение осуществляется в градиенте рН и основывается на различиях в значении изоэлектрической точки индивидуальных компонентов. 3. Изотахофорез: белки распределяются в соответствии с их электрофоретической подвижностью и мигрируют с одинаковой скоростью. 4. Электрофорез на носителях, которые могут выступать в роли простой поддерживающей среды (стабилизатора) или обладать свойствами молекулярного сита, имеющего дополнительный возможности для улучшения разделения макромолекул. Белки в электрофорезе. С точки зрения электрофореза наиболее важное значение имеют свойства белков, связанные с их ионизацией. В каждой белковой молекуле содержится множество групп, способных отдавать или принимать протоны, что приводит к образованию в первом случае отрицательно заряженных, а во втором положительно заряженных групп. Преобладание одного из этих процессов зависит от состава данного белка, а также от окружения, в котором находятся его молекулы, главным образом от рН среды. В кислой среде основные группы протонированы, тогда как диссоциация кислотных групп подавлена, поэтому белки оказываются заряженными положительно. В щелочных растворах основные группы не имеют заряда, а карбоксильные группы легко диссоциируют, вследствие чего в молекуле образуется избыток отрицательно заряженных групп. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от рН среды, а также от числа и характера ионизируемых групп. При определенном рН молекулы данного белка содержат равное число положительно и отрицательно заряженных групп: это значение рН называется изоэлектрической точкой (ПЭТ) белка. Программное обеспечение для анализа двумерных электрофореграмм. Двумерный электрофорез (2DE – two dimensional electrophoresis) представляет собой метод разделения смеси белков, основанный на последовательном использовании двух свойств белков: заряда и массы. Двумерные электрофореграммы анализируют с помощью таких программ как: компьютерные программы из пакета ImageMaster 2D Platinum, версий 6 и 7 («GE Healthcare») для решения задач, связанных с анализом распределения белковых фракций на двумерных электрофореграммах; программное сравнение двумерных электрофореграмм (PDQuest 8.0, BioRad, USA); после сканирования электрофореграмм, анализируют изображения с помощью программы MELANIE(IMAGEMASTER v.7)
46. Интегральные автоматизированные протеомные платформы, протеомно-геномно-транскрипционные платформы.

Платформа – это комплекс, служащий основой для различных с-м. В геномике и протеомике платформами яв-ся базы данных.

Биологические базы данных – это архивы согласованных данных, хранящихся в единой форме. Эти базы содержат данные широкого спектра разных областей молекулярной биологии.

Отличительные признаки БД:

1)БД хранится и обрабатывается в вычислительной с-ме.

2)Данные в БД логически систематизированы с целью обеспечения возможности их эффективного поиска и обработки в вычислительной с-ме.
3)БД включает схему, описывающие логическую стр-ру БД в формальном виде.

Все больше биол-х данных, кот-е не публикуются обычным путем, а помещаются в базы данных с присвоением уникального идентификатора для ссылки при публикации.

Традиционно изучение белков яв-сь одним из разделов биохимии, но после определения стр-ры всей геномной ДНК человека и ряда других орг-в у исследователей белков появились новые методы, с кот-ми и связывают появление нового термина протеомика. По мере сбора и накопления инф-ции о стр-ре генов и белков встала задача о необходимости сбора и обмена данными. В рез-те появились исчерпывающие протеомные базы данных о стр-ре всех белков человека, а также их протеолитических фрагментов, полученных в стандартных ус-ях. Это позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их протеолитических фрагментов. Идентификация геномов и белков по базам данных яв-ся наиболее эффективным способом на сегодняшний момент.



В зав-ти от типа информации все БД делятся на архивные, курируемые и интегрированные. В архивные любой пользователь может добавить определенные им послед-ти без какой-либо проверки их достоверности. Новая послед-ть в курируемой БД проходит оценку достоверности как самой послед-ти, так и найденных в ее составе генов и регуляторных послед-тей. Интегрированные базы данных, такие как NCBI Entrez, предоставляют возможности поиска по многим как архивным, так и курируемым базам.

Первый геном бактерии был полностью секвенирован в 1995 году. С тех пор, благодаря развитию методов секвенирования ДНК, определены нуклеотидные послед-ти геном многих видов живых орг-в.

В настоящее время сущ-ет довольно много баз данных, доступных в интернете, позволяющих работать с нуклеотидными послед-ми различных геномов. Работа с геномными базами данных осущ-ся ч\з программы, называемыми геномными браузерами, многие из кот-х доступны онлайн (н-р, Ensemble, UCSC Genome Browser и другие).

Геномные базы значительно различаются по форме и содержанию. Для наиболее важных и интересных с точки зрения генетики орг-в сущ-ют опубликованные каталоги генов и мутаций в них. Многие каталоги переведены в электронную форму.

Genomes Server(www.ebi.ac.uk/genomes/) –доступ к геномам различных орг-в.

Кроме геномных, сущ-ют еще и протеомные БД, хотя иногда два этих типа баз могут быть объединены в один. В протеомных БД (наиболее известная и качественная из них – Swiss-Prot) можно найти а\тную послед-ть белка по его названию и наоборот, вторичную, третичную и четвертичную стр-ру, если для данного белка они известны, и инф-цию о ф-ции белка, его внутриклеточном расположении, взаимодействии с другими белками и т.д.

В простейшем случае БД состоит из таблицы, содержащей точную массу, а\тную послед-ть пептида и время выхода (время начала и конца хроматографического пика).

Proteome Analysis (www.ebi.ac.uk/proteome/) - БД с упором на статический и сравнительный анализ предсказанных протеомов полностью секвенированных организмов

GenBank at the National center for Biotechnology Information (NCBI) наиболее известная БД (США).

Работа с базами данных осущ-ся на основе биоинформационных программ. Основные из них: ACT (Artemis Comparison Tool) — геномный анализ, BLAST — поиск родственных послед-тей в базе данных нуклеотидных и а\тных послед-тей.

Наиболее распространенными поисковыми движками яв-ся Mascot (MatrixScience (Darryl Pappin)), Sequest (Jimmy Eng и John Yates), и OMSSA (Национальный Институт Здоровья, США).



Протеомно-геномно-транскрипционные платформы – это БД, представляющих собой объединение протеомных и геномных баз данных.
47.Геномика и разработка новых антибактериальных препаратов.

Устойчивость микробов к антибиотикам - основная проблема здравоохранения. Существует 2 типа устойчивости: приобретенная и природная. Приобретенная устойчивость возникает в рез-те мутаций. Природная устойчивость закодирована в хромосоме, и наиболее распространенная форма - наличие множества генов для работы системы выведения антибиотика. Рез-ты геномного анализа показали, что микробные гены можно разделить на 4 типа: Консервативные гены, присутствующие в большинстве живущих орг-в; Гены, консервативные внутри определенного филогенетического царства; Гены, консервативные в пределах одного отряда или семейства; Гены, специфичные для конкретного орг-ма. Продукты генов первого типа не представляют интереса как мишени для антибиотиков, другие 3 типа обесп-ют нужный уровень селективности. Анализ геномных послед-тей показал, что около 25% бактер-х генов необходимы для роста на питательной среде. Из них 40 % не имеют аналогов в организмах млекопитающих, и продукты их генов яв-ся мишенями для новых антибиотиков. Если они присут-ют в большинстве бактерий, то они могут быть использованы для подбора антибиотиков широкого спектра. Успехи в геномике микробов продвинули исследования в области фармакологии, в частности, разработку новых видов антибиотиков и антимикробных средств. Современные антибиотики возд-ют на три главных процесса, происходящие в клетке бактерии: синтез ДНК, синтез протеинов, синтез клеточной стенки. Наибольший успех достигнут в секвенировании геномов патогенных для человека организмов и переносчиков заболеваний, что имеет непосредственное приложение к профилактике, диагностике и лечению инфекционных и трансмиссивных заболеваний. Уже секвенировано более 30 геномов важных бактерий: Saccharomyces cerevisae, Mycobacterium tuberculosis и т.д. Наличие сведений о геноме патогенного мо дает возможность унифицировать лек. средство, придать ему св-ва нейтрализовать пагубное воздействие ряда патогенов. Преимущество антибиотиков закл-ся в существенном сокращении сроков лечения, поскольку при комбинированной терапии можно одновременно бороться со всеми видами мо. При создании антимикробных лек-ых препаратов именно существенные гены (кодируемые этими генами продукты) должны быть мишенями для практически ценных антимикробных веществ. Один из недостатков большинства антибиотиков яв-я то, что они убивают как вредные, так и полезные бактерий. Н-р: гибель микрофлоры кишечника в рез-те применения антибиотиков широкого спектра действия. Т.к. антибиотики оказ-ют бактерицидное действие, сущ-ет очень сильное селективное давление на выработку устойчивости к антибиотикам. Альтернативным подходом может быть выбор в качестве мишеней белков, кот. необходимы для вирелентности, но не для роста. След-но, риск возникновения проблем токсичности был бы гораздо ниже. В бактериях имеется много различных детерминант вирулентности: токсины, адгезины, инвазины и др. Ряд подходов использован для идентификаций этих детерминант вирулентности: технология экспрессий in vivo, индукций дифференциальной флуоресценций и мутагенез методом мечения маркером. Информация о характере генной экспрессии на разных стадиях клеточного цикла у патогенных мо, обнаружение генов их вирулентности позволяет выявить новые точки возможного приложения лекарственной терапии. С помощью этого подхода, а также данных по секвенированию генома Plasmodium falciparum, удалось выявить блокатор для Plasmodium falciparum, метаболического пути, называемого DOXP. Дифференциальная индукция флуоресценций – был разработан изначально для идентификаций генов Salmonella, кот. экспрессируются в макрофагах. Мутагенез методом мечения маркеров исп-лся для идентификаций генов вирулентности бактерий. Основной принцип - создание с помощью транспозонов мутантов патогенного организма и выявление среди них, кот. выживают in vivo, но не in vitro: при сканирований всего генома выявляет гены, специф-е для выживания в опред-ой среде.
48.Геномика и разработка противовирусных препаратов

В настоящее время лицен­зированы более 30 противовирусных препаратов, но большинство из них используется против очень узкого спектра вирусов, а 50% предна­значены только для лечения ВИЧ-инфекции. Многие из них плохо переносятся людьми, так как мишени лекарств у вирусов и у их хозяев различаются незначительно. Антивирусные препараты создаются методом рационального дизайна ингибиторов, направленных на конкретные ми­шени. Для этого необходимо понимание молекулярно-биологических основ размножения вирусов. Теоретически та­кие мишени могут быть выбраны на любой стадии вирусной инфекции: прикрепление, репликация, транскрипция, трансляция, сборка, освобож­дение. На практике большинство мишеней относятся к стадиям синтеза вирусной ДНК, расщепления вирусного полипротеина и освобождения вируса из клетки хозяина. Вирусные протеазы чрезвычайно важны для жизненного цикла многих вирусов, включая ВИЧ, вирусы герпеса и риновирусы. Эти протеазы расщепляют вновь экспрессированные полипротеины-предшественники на более короткие функциональные и структурные вирусные белки. Из-за своей ключевой роли в размножении вирусов они являются привлекательными объектами для действия проти­вовирусных препаратов, и несколько ингибиторов протеаз (Pis) лицензи­рованы для лечения ВИЧ-инфекций. Вирусы используют такие же ферменты, как и их хозяева млекопитающие, что крайне затрудняет разработку нетоксич­ных противовирусных препаратов. Один из подходов, который позволяет избежать таких проблем — использование антисмысловых препаратов. Эти препараты представляют собой олиго­нуклеотиды, комплементарные специфическому участку кодируемой вирусом мРНК. Связываясь с мРНК с образованием двухспиральных струк­тур, они специфически ингибируют трансляцию кодируемых вирусом белков. Поскольку короткие олигонуклеотиды легко деградируют внутри клеток хозяина, антисмысловые лекарства синтезируются из нуклеозидных аналогов, устойчивых к действию нуклеаз. К настоящему времени только один антисмысловый препарат получил лицезию на продажу. Он предназначен для лечения ретинита, вызванного цитомегаловирусом. Ле­чение осуществляется путем прямой инъекции препарата в глазное ябло­ко. Одна из главных проблем антисмысловых препаратов — проблема дос­тавки их к мишени.
49. Токсикогеномика

Наука о том, как геном человека влияет на его ответную реакцию на токсичные вещества в окружающей среде. Токсикогеномика является одним из подразделов общей геномики, посвященном исследованию взаимосвязей между, с одной стороны, структурой и активностью генома и, с другой стороны, нежелательными биологическими эффектами экзогенных агентов. токсикогеномика: исследование изменений в экспрессии генов после введения в организм лекарства- кандидата. Токсикогеномика дает возможность идентифицировать ядо­витое для человека вещество на ранней стадии процесса его разработки и детектировать специфичные для человека яды, которые не вызывают неблагоприятных реакций у крыс.

Существует два основных пути сбора данных по генной экспрессии и использования их для предсказания токсичности. В первом случае иден­тифицируют те гены, которые экспрессируются после введения тестируе­мого лекарства и сравнивают результат с тем, который был получен при введении одного или более других лекарств того же класса, токсичность которых для человека уже известна. Во втором случае создается большая база данных по экспрессии для имеющихся на рынке фармацевтических препаратов, классических ядов и запатентованных лекарств, и это охваты­вает широкий диапазон фармакологических и структурных классов.

Исследования генной экспрессии в рамках токсикогеномики были предприняты с использованием микрочипов.



ДНК- микрочипы могут использоваться совместно с анализом аллелей и полиморфизмов единичных нуклеотидов в ходе характеристики ответов на отдельные соединения и их смеси, также, как и для оценки эффективности лекарств в ходе лечения болезней. ДНК- микрочипы являются революционной технологией для сравнения полногеномных паттернов экспрессии в зависимости от дозы и времени воздействия токсикантов. Существуют два основных типа ДНК- микрочипов. Олигонуклеотидсодержащие ДНК- чипы несут на своей поверхности короткие синтезированные олигонуклеотиды (~ 20-80 оснований). кДНК- чипы отличаются тем, что ДНК последовательности (0,5- 2 тыс.оснований в длину) соответствуют уникальным экспрессируемым последовательностям генов. ДНК- чипы могут быть высокочувствительным методом для идентификации и классификации эффектов химических соединений на организм. Существуют некоторые ограничения относительно применения технологии ДНК- чипов в токсикогеномных исследованиях, так как этот метод является полуколичественным. Помимо технологии ДНК- чипов в токсикогеномике успешно применяются и другие методы, в частности, ПЦР- реакции и исследование целостности структуры нуклеиновых кислот (ДНК- фрагментация). В настоящий момент успешно развиваются два основных направления токсикогеномики: сравнительно- предикативная и функциональная токсикогеномика. Задачей первого направления является изучение количества и типов генов, присутствующих соответственно в нормальных и подвергнутых воздействию токсиканта клетках, тканях и биожидкостях. При этом в ходе накопления результатов появляется возможность сравнения образцов, полученных от животных, подвергнутых воздействию неисследованного вещества, или же демонстрирующих наличие определенных патологических признаков, с уже существующей базой данных соответствующих показателей для хорошо изученных веществ с целью предсказания проявления некоторых свойств и эффектов у изучаемого соединения. Такой подход приводит к открытию потенциальных ранних биомаркеров токсического воздействия. Функциональная токсикогеномика предполагает исследование биологических последствий изменений генома в контексте целостного эффекта изучаемого вещества на организм.
50.Генная терапия. Пути и механизмы доставки

Генная терапия определяется как терапевтический подход, при кото­ром клетки пациента генетически модифицируются с целью облегчить течение болезни. Существует важное различие между соматической ген­ной терапией, когда модификации вводятся в соматические клетки и ог­раничены организмом пациента, и зародышевой генной терапией, когда модификации вводятся в клетки, дающие гаметы, и, таким образом, мо­гут передаваться другим поколениям. В настоящее время правовые осно­вы имеет только соматическая генная терапия. Известны несколько методов соматической генной терапии: 1.Добавление гена. Используется для лече­ния наследственных болезней, вызываемых потерей продукта функцио­нального гена. Задача терапии — добавить в геном функциональную ко­пию потерянного или мутированного гена и экспрессировать этот ген на достаточном уровне, чтобы восполнить отсутствующий белок. Метод при­меним лишь в том случае, если последствия болезни обратимы. 2.Ингибирование гена. Пригоден для лечения инфекционных и наследственных болезней. Задача терапии- введение нового гена продукт которого ингибирует экспрессию патогенного или поврежденного гена или подавляет активность продукта. 3.Заместительная генная терапия. Метод пригоден только для лечения наследственных заболеваний. Задача- ввести нормальную функционирующую копию дефектного гена, а затем заставить экзогенную ДНК рекомбинировать с целевым геном с целью замещения последнего. 4.Уничтожение специфических клеток. Пригоден для лечения болезней, которые можно лечить путем устранения определенных популяций клеток (н-р, рак). Задача- экспрессировать внутри таких клеток ген-самоубийцу, продукт которого токсичен. Выбор метода доставки ДНК зависит от доступности соответствующих клеток. Если есть возможность извлечь и культивировать клетки, не нанося вред пациенту, то их можно генетически модифицировать в культуре, а затем снова ввести в организм пациента. Такой подход, называемый ген­ная терапия ex vivo, применим для лечения заболеваний крови и иммунной системы. В случае недоступных клеток или клеток, которые невозможно эффектив­но культивировать, генная терапия включает прямое введение ДНК в клетки, находящиеся в организме. Такой подход называется генной тера­пией in vivo, а система доставки гена должна быть эффективной и селек­тивной для конкретного типа клеток-мишеней. Это особенно важно, если задачей является уничтожение данных клеток. Механизмы переноса генов могут быть вирусные и невирусные. Вирусная доставка, известная также как трансдукция, включает упаковку ДНК (или в некоторых случаях РНК) в вирусную частицу. Невирусные методы доставки генов считаются более безопасными, чем вирусные. Они включают трансфекцию (клетки заставляют поглощать ДНК из окружающей среды) и прямой перенос (ДНК вводится в клетки физическим путем, например инъекцией). ДНК не упаковывается в ви­русный вектор, а часто присутствует в составе плазмиды. ДНК может быть заключе­на в искусственные липидные везикулы — липосомы, которые способны сливаться с плазматической мембраной и доставлять свое содержимое в цитозоль. Для переноса ДНК к поверх­ности тканей существует альтернативный метод — бомбардировка частицами, при котором небольшие частицы металла покрывают ДНК и направляют с ускорением на ткань-мишень под действием высокого дав­ления воздушного потока или электрического разряда.
51. Лекарства на основе нуклеиновых кислот.

Н/к выступает в виде экзогенно вводимой мол, к-я захватывается кл-ми и препятствует экспрессии или акт-ти эндогенного гена на ур.ДНК, РНК или белка. Введение этих лек.осущ-ся с исп.невирусных методов переноса генов. Лек-е действие н/к недолговременное. Они могут излечить от инфекц.заболеваний или рака, но явл.симптоматическим лечением в случае насл.заболеваний.



1. Антисмысловые (антисенс) препараты – короткие олигон/ды, длиной 12-25 н/д, сод-е посл-ть, комплементраную кодирующей цепи гена-мишени. Могут ингибировать экспрессию поврежденного гена 2 путями. I – взаим-е антисмысловых олигон/дов с ДНК с обр.стабильного триплекса, предотвращающего транскрипцию. II – взаим-е с мРНК с обр.стабильного дуплекса, что ингибирует синт.белка и приводит к селективной деградации мРНК-мишени РНКазой Н. ДНК-олигон/ды более эффективные, т.к.они могут последов-но взаим-ть с множеством транскриптов. ДНК- и РНК-олигон/ды легко синт-ть, но они быстро расщепляются нуклеазами. В наст.время антисм.препараты явл.структурными производными н/к или синтетич.аналогами олигон-дов, сод.хим.связи, устойчивые к нуклеазам. Действие любого антисмыслового олигон/да надо устанавливать эмпирически. Сейчас для лечение цитомегаловирусных инфекций можно исп.антисм.лек-во фомивирсен (витравен).

2. Лек.на осн.рибозимов. Рибозимы – ферменты-РНК. Максизимы – модифицированные рибозимы. Их акт-ть можно регул-ть с пом.малых регуляторных мол. Прир.ф-ц многих рибозимов – катализ расщепления др.мол.РНК. Эту акт-ть можно напр.на транскрипты, получаемые с поврежденных генов, путем введения в конструкцию, сод.рибозим. Антисмысл-е посл-ти позволяют рибозиму или максизиму комплементарно связ-ся с мРНК-мишенью; транскрипт расщепляется и деградирует. Сущ.лек.-рибозим Herzyme.

3. Лек.на осн.малых интерферирующих РНК. РНК-интерференция – защ.кл.мех, при к-м дцРНК индуцирует подавление экспрессии гомологичного гена. Мех.защ.от вирусов, вкл.расщепление дцРНК, нуклеазой Dicer на фрагменты 21-25 п.н. Эти фрагменты наз.короткие интерфирирующие РНК (киРНК, siRNA), к-е затем превращаются в 1цепочечные фрагменты. Эти фрагменты связ-ся с белками и обр.РНК-индуцированный «сайленсинговый» комплекс (RISC). Он узнает комплементарные мРНК и их эффективно расщепляет. киРНК м.б.синт-ны хим-ки и введены в кл-и. Это поспособствует обр.RISC и специф-му эффекту подавления.

4. Аптамеры - олигон/ды, взаимодей-е с белками. Их можно ввести в клетку методами трансфекии. Пример исп.аптамеров – прерывание циклов размножения вирусов аптамерами, к-е прочно связ-ся с субъед-ми белка вир-й оболочки, что предотвращает их сборку.

Терапевтические подходы, базирующиеся на экспрессии антисмысловых РНК, рибозимных конструкций, киРНК, интрамеров (РНК-аптамеры, экспрессирующиеся внутри клеток для белк-й интерференции) и интрател (антитела, экспрессируемые внутри кл.для белк-й интерференции) были испол.в борьбе с ВИЧ-инфекцией и СПИДом. ВИЧ – ретровирус, поэтому в кач.мишени можно исп.г-мную РНК, или вирусные белки. Были получены антисмысловые олигон/ды, они узнают гены pol и env, кодирующие вирусную ревертазу и белки оболочки. Др.о-н/ды подавляют экспрессию генов регулят-х белков Tat и Rev. Были созданы рибозимы, расщепляющие г-м ВИЧ. Новый подход к лечению ВИЧ предполагает выс.экспрессию РНК-ловушек, несущих множество копий этих посл-й. Для блокирования сборки вирионов ВИЧ были получены аптамеры и антитела. Др.подход к леч. - суперэкспрессия мутантной формы вирусного белка, к-й препятствует ф-ц др.белков (доминантно-негативный подход).


52.Модели моногенных и комплексных болезней и мутационная геномика.

Перенос генов в чел-ом организме исп-ся для предотвращения и лечения болезней, в жив-х зачастую основная цель – вызывать болезни, что позволяет создавать модели болезней, кот. можно исп-ть для исслед-ия болезней на молек-ом уровне и тестировать новые лекарства. Технология переноса генов в позволяет вводить специф-ие послед-ти ДНК в геном клеток жив-х или точно и необходимым образом модиф-ть имеющийся геном. Поэтому мутации можно планировать и вводить конкретные гены для точной имитации чел-х болезней. Наиболее подходящим модельным организмом для большинства чел-х болезней яв-ся мышь. Для моделирования нек-х болезней пригодны также крысы, полосатый данио и даже более примитивные животные, такие как мухи и черви. Многие чел-ие болезни яв-ся рез-ом утраты функции единственного гена, и подходящие модели можно создавать путем инактивации соответствующего гена (ортолога) в другом организме. Использование организма мыши для реализации такого подхода имеет множество преимуществ, главное из которых – возможность провести эксперименты по нокауту генов, когда один – единственный ген инактивируется в результате мутации. Таким путем были созданы многие полезные мышиные модели болезней, включая синдром Леш-Нихана (дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферары, HPRT), кистозный фиброз, β-талассемию и слабой Х-хромосомы. В других случаях с использование антисмысловой РНК и аналогичных подходов был достигнут эффект утраты функции генов. Н-р, мышиная модель диабета была получена путем специф-ой экспрессии рибозима, направленного против мРНК глюкокиназы в β-клетках поджелудочной железы, а модели нескольких болезней на базе полосатого данио были получены с использованием антисмысловых морфолино-олигонуклеотидов. По мере модернизации таких подходов появ-ся много общего м/у созданием моделей болезней и методами функциональной геномики – широкомасштабным мутагенезом и скринингом путем интерференции. Болезни, вызываемые доминантными мутациями, приводящими к приобретению функции, могут быть моделированы просто переносом гена с эквивалентной мутацией в геном мыши с помощью обычных технологий переноса генов. Н-р, мышиные модели болезни Альцгеймера были получены суперэкспрессией гена белка – предшественника амилоида, а модель синдрома Вернера (преждевременного старения) – путем экспрессии доминантно-негативного мутанта гена WRN. Были получены мышиные модели, удобные для изучения болезней триплетных повторов, н-р спиномозжечковой атаксии 1 типа, вызываемой экспансией микросателлитных повторов внутри генов.

Для моделирования чел-х болезней на мышах им-ся опред-ные ограничения, что связано с био и ген-ми различиями м/у мышами и людьми. Завершенное секвенирование генома мыши показало, что в нем нет ортологов для некот-х чел-их генов. Кроме того, лабораторные мыши представляют собой инбредные популяции, а человек – аутбредные, так что различия в ген-х особенностях оказ-ют небольшой эффект. Все это вместе обусл-ет биохим. и физиол. различия, кот. иногда приводят к совершенно разным фенотип-им проявлениям заболеваний. В качестве примера можно привести болезнь Тэя-Сакса, кот. вызывается потерей функции гена HEXA, кодирующего гексозамининидазу А. Это приводит к накоплению в нейронах мозга гликолипидных молекул, известных как ганглиозиды GM2, что ведет к прогрессирующей нейродегенерации и, в конце концов, к смерти. Болезнь Тэя-Сакса может быть моделирования на мышах путем инактивациии соответствующего гена HEXA, но при этом, хотя и происходит накопление ганглиозидов GM2, не наблюдается характерных для заболевания человека симптомов: трудностей с обучением и утраты моторных функций.

Расшифровка посл-ти г-ма чел.позволила идентиф-ть гены, свзяанные с рядом комплексных болезней (болезни, возникающие под действием множества генет-х и внешних факторов, к-е не хар-ся простыми паттернами наследования). Моделировать комплексные болезни сложнее всего. Но сущ.успешные эксперименты: при скрещивании линии мутантных мышей с целью накопления нескольких мутаций в 1м орг. Напр., потомки, полученные от скрещивания волнистых и пятнистых мышей, привели к созданию хорошей модели врожденного дефекта расщелины позвоночника без спинномозговой грыжи. Трансгенные мыши, суперэкспрессирующие чел.β-глобин и мутантную форму β-глобина чел.,к-я стимулирвует полимеризацию, обесп.хор.модели для серповиднокл-й анемии. Однако когда этих мышей скрещивают с мышами, экспрессирующими чел-й зародышевый гемоглобин в период полового созревания, то у гибридов обнаруживается поразительное умен.симптомов болезни. Возможно, исп.зародышевого гемоглобина способно помочь в борьбе с серповиднокл-й анемией у чел.


53. Клеточная терапия

Кл.терапия осн.на исп.кл.в кач.терапевтических агентов. Часто кл.исп-ся для замены поврежденных или старых кл.у больного. Типичный пример – пересадка кожи при лечении ожогов. Большие надежды связаны со стволовыми кл (СК)., к-е самовоспроизводятся. Разл.2 типа СК.: эмбриональные (ES) и взрослые. ES получают из чел-го эмбриона на ранней стадии разв., они обладают плюрипотентностью. Их можно заставить дифференцироваться альтернативными путями. Возможно, эмбр.кл можно будет исп.для выращивания замещающих кл., тк., целых органов. Многие СК взрослых обл.спос-тью давать одну дочернюю СК, II – к-я подвергнется дифференциации. Такие кл.найдены во многих тк.: гемопоэтические (кл.крови и иммун.сист.), СК мозга (дают нач.нейронам и гликальным кл.), мышечные СК и СК кожи. СК мультипотентны. Однако СК взрослых в нек-х случаях могут подвергаться трансдифференциации, т.е.давать начало нетипичным дочерним кл. Появляется возможность исп.легко изолирумые СК, напр.из костного мозга для лечения болезни Паркинсона.

Одна из проблем кл-й терапии – острое отторжение, когда иммунная сист.реципиента распознает кл.как чужие и делает попытку их разрушить. Проблему можно избежать, если исп.СК самого пациента, но в большинстве случаем это невозможно. Клонирование – один из путей решения этой проблемы. При клон-и исп-ся ядро из кл.пациента для замещения ядра в оплодотворенной кл. Полученный эмбрион несет тот же генетич-й материал и м.б.источником совместимых с организмом пациента СК. Этот проц.наз.терапевтическое клон-е. Оно вызывает серьезные возражения с этической точки зрения.

Трансплантация ор. Недостаток: длительное ожидание появление подходящего донора. Гл.проблема: острое отторжение. В будущем планируется получать ф-циональные ор.от трансгенных ж-х (свиней). Этот подход наз-ся ксенотрансплантацией. Также вызывает множ-во споров. Есть опасность рекомбинации ретровирусов свиней с ретровирусами чел.и появления мощных гибридов с неизв.св-вами. Также сущ.технические трудности: узнавание хозяйской иммунной сист.свиных антигенов в донорской ткани. Было изучено неск.методов с целью преодоления р-ц отторжения: экспрессия в донорском ор.белков, инактивирующих сист.комплемента, экспрессия антител против иммуногенной дисахаридной гр.; введение генов, код-х др.ферменты, метаболизирующие сахара. Могут также возникнуть проблемы, вкл.отложенную иммунную р-ц отторжения с уч.прир-х кл.-киллеров и макрофагов и требование толерантности Т-кл.


Данные для задач:

Mr а/к=110 Да (есть значения 100, 110 и 120)

Mr н/д=300 Да

l н/д =0,34 нм

3 н/д =1 триплет =1 а/к = 1тРНК

В ДНК – 2 цепи, в мРНК – 1!



Примеры решения задач:

Участок цепи молекулы ДНК имеет последовательность нуклеотидов: Ц-Т-А-А-Ц-Ц-А-Т-А-Г-Т-Т-Г-А-Г. Запишите последовательность нуклеотидов иРНК.



Дано: ДНК Ц-Т-А-А- Ц-Ц-А-Т-А-Г-Т-Т- Г- А- Г

Решение: (нуклеотиды иРНК подбираем по принципу комплементарности к ДНК : А-У, Г-Ц) 

ДНК Ц Т А А Ц Ц А Т А Г Т Т Г А Г

 иРНК Г А У У Г Г У А У Ц А А Ц У Ц

Ответ : иРНК имеет последовательность нуклеотидов Г-А-У-У-Г- Г-У-А-У-Ц-А-А-Ц-У-Ц
Определите последовательность нуклеотидов иРНК, антикодоны молекул тРНК , если фрагмент ДНК имеет последовательность нуклеотидов

Г-Ц-Ц-Т-А-Ц-Т-А-А-Г-Т-Ц



Дано: ДНК Г-Ц-Ц-Т-А-Ц-Т-А-А-Г-Т-Ц

Решение: (нуклеотиды подбираем по принципу комплементарности А-У, Г-Ц под ДНК сначала строим иРНК, затем тРНК)

ДНК Г Ц Ц Т А Ц Т А А Г Т Ц

иРНК Ц Г Г А У Г А У У Ц А Г

тРНК Г Ц Ц У А Ц У А А Г У Ц




2. В-форма кристаллической ДНК устойчива в 97% относительной влажности. Если влажность понизить до 76%, то В-форма переходит в А-форму. Вычислить на какую величину изменяется длина фрагмента ДНК с определенной молекулярной массой в Да.

( определить послед-ть нк в В и А формах. Как меняется шаг спирали)

В-форма: Длина витка спирали – 3,4 нм

На один виток спирали – 10 нуклеотидов

Межнуклеотидное расстояние – 0,34 нм

Mr н/да=300 Да



А-форма: В А-форме пары оснований наклонены к оси спирали под углом около 20 градусов, в результате чего шаг спирали уменьшается с 3,4 до 2,8 нм.

В А-форме насчитывается 11 пар оснований на виток, что приводит к укорачиванию цепи приблизительно на 25%.


4. в мРНК содержатся нк, кот составляют сколько-то %. найти нк состав участка 2-цепочечного ДНК, с кот осуществлен синтез мРНК.

В состав иРНК входят нуклеотиды: аденина 28%, гуанина 16%, урацила 24%. Определите процентный состав нуклеотидов в двуцепочечной молекулы ДНК, информация с которой «переписана» на иРНК



Дано: нуклеотидов в иРНК: А-28%, У-24%, Г-16%.

Найти: % А, Т, Ц, Г в ДНК.

Решение:

Определяем процентное содержание цитозина в иРНК, учитывая, что сумма всех нуклеотидов иРНК составляет 100%:

100 - ( 24+28+16) = 32% (Ц)

Учитывая принцип комплементарности ( А=Т, У=А, Г=Ц, Ц=Г), вычисляем процентный состав нуклеотидов цепи ДНК, с которой была списана информация на и РНК. Сумма всех нуклеотидов в двух цепях ДНК составляет 100%:

Т=28:2=14%, Г= 32:2=16%, А=24:2=12%, Ц=16:2=8%

Вторая цепочка ДНК является комплементарной первой, следовательно, в ней процентный состав нуклеотидов следующий:

А=14%, Ц=16%, Т=12%, Г=8%

В двуцепочечной ДНК процентное содержание нуклеотидов будет таким:

А = 12+14=26%, Т= 14+12=26%, Г=16+8=24%, Ц= 8+16=24%



Ответ: в двух цепях ДНК % состав нуклеотидов: Т -26%, А-26%,

Г-24%, Ц-24%
Каталог: uploads
uploads -> Стоматология история открытий
uploads -> Санкт-Петербург Москва
uploads -> В интернатуру/ординатуру на конкурсной основе принимаются лица, имеющие высшее профессиональное образование
uploads -> Занятие №1 Эргономика в стоматологии. Ручные дентальные вращающиеся инструменты. Вспомогательные приспособления и средства для эстетической реставрации зубов, их назначение. Средства изоляции от ротовой жидкости
uploads -> Тема №1 Клинические и лабораторные этапы изготовления вкладок, виниров. Особенности одонтопрепарирования под вкладки, виниры. Моделирование вкладок, виниров из воска, пластмассы
uploads -> Дважды в день следует чистить зубы, межзубные промежутки, после чего полоскать ротовую полость с помощью ополаскивателя
uploads -> Профилактика кариеса и заболеваний десен
uploads -> Памятка после санации и/или после проведения профессиональной гигиены полости рта


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4


База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница