И молекулярно-цитогенетическое исследование синдрома вильямса



Скачать 287,48 Kb.
страница1/2
Дата01.08.2018
Размер287,48 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2


На правах рукописи


Прокофьева Алёна Дмитриевна

КЛИНИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ СИНДРОМА ВИЛЬЯМСА

Специальность: 03.00.15 — генетика

14.00.09 — педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ


диссертации на соискание

учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2006
Работа выполнена на кафедре медицинской генетики Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», в Санкт-Петербургском Государственном учреждении здравоохранения «Диагностический центр (медико-генетический)» Комитета по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга, в лаборатории Стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии Российской Академии Наук.

.

Научные руководители:



  • доктор биологических наук, профессор Н.В.Томилин,

  • доктор медицинских наук О.П. Романенко


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. Н. Петрин

кандидат медицинских наук, доцент А.Н.Прытков
Ведущее учреждение:

НИИ экспериментальной медицины РАМН


Защита состоится 25 сентября 2006 г., в 11-00 на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Государственном учреждении «Медико-генетический научный центр Российской Академии медицинских наук» по адресу: г. Москва, ул. Москворечье, 1 …

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН


Автореферат разослан 24/У111-2006
Учёный секретарь Диссертационного совета д.б.н., профессор Л.Ф. Курило.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования: В структуре задержки психического развития у детей синдром Вильямса (СВ) является одной из распространённых, нозологически самостоятельных форм умственной отсталости и по значимости занимает третье место после синдрома Дауна и фенилкетонурии (Г.С. Маринчева, В.И. Гаврилов, 1988). СВ был впервые описан в середине ХХ века Fanconi с соавт. (1952), и до конца прошлого столетия его диагностика проводилась на основании клинических данных, поскольку у больных как правило определяется нормальный кариотип (A.K. Ewart и др., 1993; E. Nickerson и др., 1995; L.A. Perez Jurado и др., 1996). После стремительного развития методов молекулярной генетики, открытия критического района генома 7q11.23 и описания гемизиготной делеции гена эластина в этом районе при СВ (A.K. Ewart и др., 1993) стала доступной диагностика этого заболевания на молекулярном уровне. В настоящее время в различных странах для подтверждения клинического диагноза СВ используется молекулярное и молекулярно-цитогенетическое исследование.

Для СВ характерно умеренное снижение интеллекта, что, в сочетании с относительно сохранным речевым развитием и часто выраженными музыкальными способностями, создаёт благоприятную почву для социальной реабилитации больных (Г.С. Маринчева, В.И. Гаврилов, 1988). В последнее время большое внимание уделяется полиорганному характеру поражения организма при данном заболевании, что также требуется учитывать при планировании реабилитационных мероприятий для конкретного пациента (K. Metcalfe, 1999).

Данные о частоте СВ в Санкт-Петербурге при изучении литературы не найдены. Молекулярно-цитогенетическая диагностика этого синдрома в России проводится в Государственном Учреждении «Медико-генетический научный центр Российской Академии Медицинских Наук» (Москва).

Цель работы: На основании комплексного — клинического и молекулярно-цитогенетического — подхода изучить СВ у детей и обосновать рекомендации по улучшению диагностики данного заболевания.

Задачи исследования:


  1. Изучить клиническую картину у больных с СВ: выявить характерные симптомы заболевания и дополнительные особенности.

  2. На основе предоставленных продуктов первичной амплификации искусственных дрожжевых хромосом создать в лабораторных условиях ДНК-зонды, пригодные для проведения молекулярно-цитогенетическое исследования; произвести оценку специфичности и чувствительности полученных ДНК-зондов, осуществив молекулярно-цитогенетическое исследование на контрольном материале (хромосомных препаратах, полученных от лиц без клинической симптоматики СВ).

  3. Провести молекулярно-цитогенетическое исследование на хромосомных препаратах, полученных от больных с СВ, с применением созданных ДНК-зондов.

  4. Сопоставить клиническую картину с данными молекулярно-цитогенетического исследования при СВ.

Научная новизна: Впервые в России показано, что для подтверждения клинического диагноза синдрома Вильямса можно и нужно использовать высокоточного современного метода FISH с несколькими локус-специфичными ДНК-зондами, целиком перекрывающими критический для СВ район 7 хромосомы (7q11.2). Выявлены варианты делеций: STS-маркера D7S489B, STS-маркера D7S672 и обоих исследованных STS-маркеров (D7S489B и D7S672).

Впервые описан феномен дополнительной микроделеции в прицентромерной области 7р11.1-7р11.2 при наличии делеции STS-маркера D7S489B в критическом для СВ районе 7q11.2, а также при дизиготном состоянии локусов D7S494 и D7S672.

Впервые проведено сопоставление типичных клинических проявлений СВ с делециями в области STS-маркеров: D7S489B (7q11.2), D7S672 (7q11.2), D7S494 (7p11.1-7p11.2) у больных с СВ, не являющихся родственниками. Впервые сопоставлены дополнительно выявленные аномалии и особенности фенотипа у больных с СВ, не являющихся родственниками, и делеции в области STS-маркеров: D7S489B (7q11.2), D7S672 (7q11.2), D7S494 (7p11.1-7p11.2). Впервые установлено сочетание поздней гиперкальцемии с одновременной делецией двух STS-локусов D7S489B (7q11.2) и D7S494 (7p11.1-7p11.2). Впервые выявлена гипокальцемия при синдроме Вильямса при различных вариантах делеций исследованных STS-маркеров. Впервые установлена артериальная гипотензия (в сочетании с анамнестической гиперкальцемией) при наличии гемизиготных делеций в двух STS-локусах: D7S489B (7q11.2) и D7S494 (7p11.1-7p11.2).

Практическая значимость:


  1. Показаны индивидуальная вариабельность типичных симптомов, возможное наличие нетипичных пороков развития, микроаномалий и функциональных особенностей при СВ, что должно учитываться при клинической диагностике и диспансерном наблюдении этих больных.

  2. Продемонстрирована адекватность и необходимость молекулярно-цитогенетического исследования критического района 7 хромосомы при СВ с применением двух использованных ДНК-зондов 743 g06 (STS-маркер D7S489B) и 893 b12 (STS-маркер D7S672) для уточнения протяжённости делеции.

  3. Впервые установленный феномен делеции STS-маркера D7S494 в прицентромерной области 7р11.1-7р11.2 при наличии микроделеции в районе 7q11.2 может быть использован для дальнейшего изучения механизма возникновения микроделеции в критическом для СВ районе и разработки концепции медико-генетического консультирования семей с пробандами, страдающими СВ.

Внедрение в практику: Вариабельность клинической картины СВ учитывается врачами-генетиками Санкт-Петербургском Государственном учреждении здравоохранения «Диагностический центр (медико-генетический)» Комитета по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга (МГЦ) при исследовании фенотипа больных с подозрением на диагноз: синдром Вильямса.

Молекулярно-цитогенетический метод обследования используется для верификации клинического диагноза СВ у больных, проходящих обследование в МГЦ.

Разработанные рекомендации по диспансерному наблюдению больных с установленным диагнозом синдрома Вильямса используются врачами-генетиками МГЦ в клинической работе.

Данные, полученные в ходе исследования, используются при подготовке лекционного материала сотрудниками кафедры медицинской генетики Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования (ГОУ ДПО) «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального Агентства по Здравоохранению и социальному развитию».



Положения, выносимые на защиту:

1. Клинической картине синдрома Вильямса присуща индивидуальная вариабельность типичных симптомов. Характерный фенотип может включать дополнительные врождённые пороки, микроаномалии и функциональные особенности.

2. Уровни специфичности и чувствительности созданных ДНК-зондов являются достаточными для выявления делеции соответствующих STS-маркеров.

3. Молекулярно-цитогенетический метод исследования (флюоресцентная гибридизация in situ, на хромосомных препаратах) является основным и необходимым лабораторным способом подтверждения клинического диагноза синдрома Вильямса. Хромосомная микроделеция в критическом районе длинного плеча 7 хромосомы имеет варьирующую протяжённость. В некоторых случаях при синдроме Вильямса обнаруживается дополнительная делеция за пределами критического района, в прицентромерной области короткого плеча 7 хромосомы.

4. Выявленные варианты изменения структуры 7 хромосомы не имеют специфических клинических проявлений.

Апробация работы: Основные результаты диссертации отражены в 6 опубликованных работах и представлены на конференции “Лабораторная медицина — взгляд в будущее” (Санкт-Петербург, 2001), доложены на заседании кафедры медицинской генетики ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Санкт-Петербург, 2002), Международной конференции “Врачи мира — пациентам” (Санкт-Петербург, 2003), на семинарах Государственного учреждения «Медико-генетический научный центр РАМН» (Москва, 2004, 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в центральных научных журналах.

Объём и структура работы: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов работы, трёх глав собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Текст изложен на 190 страницах, содержит 16 рисунков и 50 таблиц. Список литературы содержит 133 источника, включая 11 отечественных и 122 — зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Настоящая работа выполнена на кафедре медицинской генетики ГОУ ДПО «Санкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования Федерального Агентства по Здравоохранению и социальному развитию», в МГЦ, в лаборатории Стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН.

Обследовано 9 пациентов в возрасте от 2 до 17 лет с клинической картиной СВ с применением следующих методов: анамнестического, клинико-морфологического, цитогенетического и молекулярно-цитогенетического (флюоресцентная гибридизация на хромосомных препаратах (in situ), FISH), статистического, клинико-генеалогического. На основании анамнестического метода была собрана информация о физическом и психическом развитии больных детей, фенотипе «лицо эльфа», а также о ряде функциональных особенностей в каждом конкретном случае до проведения данного исследования. Клинико-морфологический метод включал антропометрию, детальное описание фенотипа по оригинальному плану (число типичных и дополнительных лицевых дисморфий, число признаков изменения соединительной ткани, опорно-двигательного аппарата, зрительного анализатора, особенности локомоции, некоторые показатели психо-эмоционального статуса), аускультацию, пальпацию, оценку степени выраженности вторичных половых признаков. Цитогенетическое исследование было проведено по общепринятой методике, которая включала следующие этапы: культивирование лимфоцитов периферической крови (72 часа), введение колхицина в стандартном разведении за 1,5 часа до окончания культивирования; обработка гипотоническим раствором (0,55% KCl) в течение 20 мин., фиксация смесью этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (в соотношении 1:3), приготовление хромосомных препаратов, окрашивание по GTG-методу, микроскопирование. Молекулярно-цитогенетический метод был использован для исследования критического района 7q11.2 с помощью ДНК-зондов: 743 g06 (STS-маркер D7S489B), 893 b12 (STS-маркер D7S672), 880 а10 (STS-маркер D7S2549) а также для исследования прицентромерной области короткого плеча 7 хромосомы с применением ДНК-зонда 946 h08 (STS-маркер D7S494). Для проведения FISH использовались хромосомные препараты, полученные цитогенетическим методом с небольшой модификацией: высушивание производилось над пламенем спиртовки с минимальным тепловым воздействием; хранение в 70% этаноле в течение 10-14 дней при +4°С. В качестве ДНК-зондов был использован набор биотинилированных продуктов повторной амплификации фрагментов человеческого генома, первоначально находившихся в виде продукта первичной амплификации YAC (yeast artificial chromosome, искусственная дрожжевая хромосома). Процедура получения и очистки биотинилированных продуктов повторной амплификации была полностью проведена нами в лабораторных условиях.

Перечень и характеристики YAC, использованных для создания ДНК-зондов, представлены в таблице 1.

Для проведения молекулярно-цитогенетического исследования нам было предоставлено по одному образцу продукта первичной амплификации вставки человеческой ДНК в соответствующих шести YAC. Первичная амплификация (полимеразная цепная реакция, ПЦР) была проведена с помощью дегенеративного олигонуклеотидного праймера (ДОП) для всех использованных YAC и обозначалась как ДОП-ПЦР-1. На первом этапе исследования проводилась повторная амплифицикации с помощью ДОП (ДОП-ПЦР-2) для накопления материала по прилагавшемуся протоколу.

Таблица 1

Характеристики YAC, использованных для обследования пациентов с фенотипом синдрома Вильямса (опубликованы на интернет-сайте Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Берлин, Германия).

Обозначение YAC

Локализация СГ* в геноме

Соответствующий STS-маркер

Локализация STS-маркера в 7 хромосоме, по данным:

Sequence Map, п.н. /

deCode Map, сМ /

Radiation Hybrid Mapping



Длина, т.п.н.

Вторичные СГ*

743 g06

7q11.2

D7S489В

71912480-71912902

394,7 cR3000



1640

5q14, 6q21

893 b12

7q11.2

D7S672

70929546- 71307418

84,6-84,9



720

11q12

880 a10

7q11.2

D7S2549

62647936-64838974

77,91-79,6



820



946 h08

7р11.1-7р11.2

D7S494

57292183-57728878

76,71/78,49

239,8 cR3000


1280



660 g06

7p22

D7S517

4271159-4561801

8,69


14,2 cR3000

130



965 c12

7q36

D7S550

153556087-155017279

181


681,93 cR3000

160



* — сайт гибридизации
Продукты ДОП-ПЦР-2 были помечены с помощью биотин-16-2-дезоксиуридин-5-трифосфата по модифицированному протоколу для ДОП-ПЦР-2. Очистка меченых образцов осуществлялась методом фильтрации в колонках, заполненных сефадексом G-50, по стандартному протоколу. FISH проводилась по стандартному протоколу с модификациями времени денатурации ДНК хромосом и ДНК-зондов, а также предгибридизационной подготовки ДНК-зондов (эмпирический подбор количества Cot-1-ДНК, ДНК селезёнки крупного рогатого скота, обработанной ультразвуком). Для каждой реакции гибридизации использовался как минимум один ДНК-зонд для идентификации 7 хромосомы и всегда только один ДНК-зонд для исследования района, ответственного за СВ. Для иммунофлюоресцентной детекции биотина в красном свете использовались авидин, конъюгированный с Техасом красным, и биотинилированные козлиные моноклональные антитела к авидину (стандартный протокол). Окрашивание хромосом для визуализации производилось флюоресцентным красителем 4,6-диамидино-2-фенилиндол-2-HCl (стандартный протокол). Флюоресцентная микроскопия производилась с одновременным сохранением изображений в цифровом виде. Применяя метод FISH на контрольном материале (хромосомные препараты от 17 индивидуумов без клинических признаков СВ), мы провели оценку специфичности и чувствительности подготовленных нами ДНК-зондов, которые оказались адекватными задаче молекулярно-цитогенетического обследования больных с СВ. При обработке результатов FISH, проведённой на хромосомных препаратах, полученных от больных с СВ, мы применяли статистический анализ для установления достоверности полученных данных на предмет наличия либо отсутствия делеции сайта гибридизации для использованного ДНК-зонда у конкретного обследованного больного. Методом анализа было выбрано определение достоверности различия по критерию 2 между совокупностью метафазных пластинок в контрольном и опытном материале для каждого использованного ДНК-зонда. Поскольку задача анализа совокупности данных, полученных при исследовании больных с СВ и контрольной группы, является задачей анализа альтернативного распределения, анализируемые данные записывались в виде четырёхпольной таблицы в каждом случае применения данного ДНК-зонда у данного пациента. Число степеней свободы составило k=(S - 1)×(r -1)=1, где S=2 — число граф (без итоговой графы), r=2 — число строк (без итоговой строки), 1 — константа. Поскольку во всех случаях как минимум в одной клетке четырёхпольной таблицы число наблюдений составляло величину, меньшую 4, для вычисления величины 2 была использована формула с поправкой Йетса:

2 = (1),

где а — число пластинок с одним сигналом исследуемого ДНК-зонда у больного с СВ; b — число пластинок с двумя сигналами ДНК-зонда у больного с СВ; c — число пластинок с одним сигналом ДНК-зонда в контрольной группе; d — число пластинок с двумя сигналами ДНК-зонда в контрольной группе; n = a + b + c + d.

Нулевая гипотеза была сформулирована следующим образом: число а появилось вследствие случайного стечения обстоятельств и, таким образом, отсутствует доказательство наличия делеции исследуемого STS-маркера (отсутствие сайта гибридизации (СГ) для данного ДНК-зонда, имеющего сайт гибридизации в сегменте 7q11.2 либо 7р11.1). Уровень значимости для вероятности α-ошибки (рα) был определён <0,05. Расчёт по формуле был выполнен с помощью компьютерной программы Maple 8.0. Поскольку во всех случаях k = 1, оценка полученного χ2 проводилась по таблице граничных значений χ2 для одной степени свободы с принятым уровнем рα значимости <0,05. В тех случаях, когда полученное значение χ2 превышало табличное значение 3,84, нулевая гипотеза была отвергнута, что подтверждало наличие делеции СГ данного ДНК-зонда (7q11.2/7р11.1) у данного больного. В тех случаях, когда полученное значение χ2 было меньше табличного значения 3,84, нулевая гипотеза была подтверждена, а следовательно, было подтверждено отсутствие делеции исследуемого STS-маркера (наличие СГ для данного ДНК-зонда (7q11.2/7р11.1) в обоих гомологах 7 пары хромосом) у данного больного.

Применение формулы с поправкой Йетса (1) в ряде случаев привело к противоречивым результатам, когда полученное значение χ2 превышало табличное значение 3,84 при заданном уровне рα <0,05, в соответствии с чем нулевую гипотезу требовалось отвергнуть и, таким образом, подтвердить наличие делеции исследуемого STS-маркера. Однако в этих случаях формулируемый вывод противоречил фактическому результату исследования, при котором у обследованного не было зафиксировано ни одной пластинки с одним сигналом от данного ДНК-зонда, то есть возникала α-ошибка (I рода). Отметим, что расчёт χ2 по формуле для альтернативного распределения без поправки Йетса привёл к аналогичному противоречию во всех этих случаях. Для того чтобы не возникала α-ошибка (I рода), нами в рассматриваемой группе случаях для статистической оценки данных был использован точный критерий Фишера, вычислявшийся по формуле:



(2),

где а — число пластинок с одним сигналом исследуемого ДНК-зонда у больного с СВ; b — число пластинок с двумя сигналами от ДНК-зонда у больного с СВ; c — число пластинок с одним сигналом от ДНК-зонда в контрольной группе; d — число пластинок с двумя сигналами от ДНК-зонда в контрольной группе; n = a + b + +c + d. При получении значения р = рα > 0,05 нулевая гипотеза не могла быть отвергнута.

Проведены сбор анамнеза (в том числе акушерско-гинекологический у матерей) и оценка фенотипа родителей больных детей по оригинальному плану (в том числе количественная оценка особенных черт лица).



Поделитесь с Вашими друзьями:
  1   2


База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница