Нижегородская государственная



Скачать 156,22 Kb.

Дата02.01.2017
Размер156,22 Kb.

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития

Фармацевтический факультет

__________________________

Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии
Химико-токсикологический анализ на группу веществ,
изолируемых экстракцией и сорбцией
(барбитураты)




Учебно–методическое пособие для студентов 4 курса фармацевтического факультета
Количество часов:
Лекционных – 2
Лабораторно-практических - 10
Нижний Новгород
2009

2
Химико-токсикологический анализ на группу веществ, изолируемых экстракцией и сорбцией (барбитураты). Учебно–методическое пособие для студентов 4 курса фармацевтического факультета – Нижний Новгород: изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2009.
Учебно-методическое пособие составлено для студентов 4 курса фармацевтического факультета. В пособии рассмотрены метод изолирования барбитуратов из биологического материала, их качественное и количественное определение, обнаружение и разделение методом ТСХ.
Рекомендовано к изданию ЦМС Нижегородской государственной медицинской академии (протокол № 1 от 16.02.09).
Составители: С.А. Гаврилова, Л.Н. Карякина, Н.Б. Мельникова, Т.В.
Саликова.
Рецензенты:
С.А. Гаврилова,
Л.Н. Карякина,
Н.Б. Мельникова,
Т.В. Саликова

3
Химико-токсикологический анализ на группу веществ,
изолируемых экстракцией и сорбцией
(барбитураты)
1.

ВВЕДЕНИЕ
Производные барбитуровой кислоты
– барбитал, фенобарбитал, барбамил, этаминал-натрия, бутобарбитал и бензонал – извлекаются из кислого раствора органическим растворителем. В качестве биологического материала берется содержимое желудка, печень, почки, моча.
2.

ИЗОЛИРОВАНИЕ
Изолирование подкисленным спиртом.
Измельченный объект (100 г) (если объект полужидкий – упаривают на водяной бане 40 0
С до густоты сиропа; если объект жидкий – извлекают органическим растворителем сначала из кислого раствора, затем из щелочного) помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 96% спиртом с таким расчетом, чтобы твердые части объекта были полностью покрыты им; полученную смесь подкисляют 5 – 10 % спиртовым раствором щавелевой кислоты до pH 2,5 – 3 и оставляют до следующего дня при периодическом взбалтывании.
На следующий день при сохранившейся кислой реакции объекта исследования спиртовое извлечение фильтруют через складчатый фильтр, предварительно смоченный спиртом (реакция извлечения должна быть кислой), и собирают в фарфоровую чашку емкостью 200 – 250 мл, выпаривают на водяной бане до густоты сиропа при температуре не выше 40 – 50 0
С.

4
C
2
H
5
OH
измельчение * - в зависимости от вида объекта щавелевая к-та упаривание экстракция
CHCl
3
NH
4
OH экстракция
CHCl
3 фильтрация выпаривание осаждение белков
96% спиртом фильтрация выпаривание до отрицательной реакции
H
2
O горячая фильтрация
Рис. 1. Схема изолирования из биологического материала. биологический материал спиртовая вытяжка кислая

качественный анализ
I
экстракт хлороформный водно-спиртовый остаток водно-спиртовая вытяжка щелочная

II
экстракт хлороформный спиртовый фильтрат
сироп
мутный раствор
прозрачный раствор твердый остаток на фильтре сироп
мутный раствор
прозрачный раствор количественный анализ
«Извлечение из кислого раствора»
качественный анализ
количественный анализ
«Извлечение из кислого раствора»

5
В сиропообразном остатке производят осаждение белков, для чего остаток повторно обрабатывают 96 % спиртом, приливая его тонкой струйкой, а затем по каплям и непрерывно перемешивая жидкость стеклянной палочкой; спирт добавляется до тех пор, пока следующая капля спирта не перестанет вызывать помутнение жидкости. Образовавшемуся осадку дают отстояться в течение 10 –
15 минут и отфильтровывают его через гладкий маленький фильтр
(5 – 6 см в диаметре), предварительно смоченный спиртом.
Остаток на фильтре промывают (по каплям) несколькими миллилитрами спирта. Фильтрат собирают в фарфоровую чашечку, сгущают его на водяной бане до густоты сиропа и снова повторяют операцию осаждения белков.
Операцию осаждения белков производят несколько раз (2 – 3 раза и более) до тех пор, пока спирт не перестанет что-либо осаждать.
В последний раз вытяжку выпаривают на водяной бане до густоты сиропа, остаток растворяют в 25 – 30 мл горячей дистиллированной воды (
50 0
С) и мутный раствор фильтруют через небольшой гладкий фильтр, смоченный водой.
Фильтрат собирают в делительную воронку и трижды экстрагируют его хлороформом (15, 10 и 10 мл).
Соединенные вместе хлороформные извлечения фильтруют через маленький фильтр с безводным сульфатом натрия, смоченный хлороформом, и помещают в маленькую сухую колбу
(на 25 мл), которую снабжают этикеткой «Извлечение из кислого раствора».

6
Водный остаток в делительной воронке подщелачивают 25 % раствором аммиака до pH 8,5 – 9 и вновь извлекают 3 порциями хлороформа (15, 10 и 10 мл).
С объединенными хлороформными извлечениями поступают, как указывалось выше. После фильтрования их помещают в сухую колбу и снабжают этикеткой «Извлечение из щелочного раствора».
3.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Описанные ниже качественные реакции изучаются сначала на водных или хлороформных растворах (или сухом остатке) известных веществ. При выполнении контрольной задачи описанные реакции применяют к исследованию экстракта после удаления органического растворителя.
При проведении микрокристаллоскопических реакций необходимо зарисовать форму кристаллов для каждого из барбитуратов.
3.1. Общие реакции на барбитураты
3.1.1.Реакция с аммиачным раствором нитрата или ацетата
кобальта. При значительных количествах исследуемого вещества к остатку после удаления хлороформа в фарфоровой чашке добавляют каплю свежеприготовленного аммиачного раствора нитрата кобальта (раствор готовится перед употреблением из равных объемов 1% раствора нитрата кобальта и 25% раствора аммиака) или каплю 1 % раствора нитрата кобальта и каплю 25% раствора аммиака.

7
При наличии барбитуратов появляется красно- фиолетовое окрашивание.
3.1.2.

Мурексидная проба. Раствор исследуемого вещества в этиловом спирте помещают в фарфоровую чашку, спирт осторожно испаряют, к остатку добавляют 0,1 мл раствора хлорида аммония, содержащего следы соли
Мора, и 0, 1 мл 30% раствора перекиси водорода.
Реакционную смесь перемешивают и чашку нагревают на спиртовке. Через 5 минут по краям сухого остатка появляется розовое или красное окрашивание.
Окрашивание становится интенсивнее при нанесении на остаток капли 25% раствора аммиака.
Чувствительность реакции различна для каждого из барбитуратов. В среднем она составляет 3-5 мг вещества в пробе.
3.1.3.Реакция выделения кислотной формы барбитуратов. На предметное стекло наслаивают несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества, удаляя хлороформ при комнатной температуре. Следующую каплю наносят после испарения предыдущей. Сухой остаток растворяют в капле концентрированной серной кислоты. Через 3-5 минут рядом с этой каплей помещают

8
одну каплю дистиллированной воды, после чего их осторожно соединяют при помощи капилляра. Через 10-
20 минут наблюдают появление кристаллического осадка, характерного для каждого отдельного барбитурата (рис. 2-5).
Рис. 2. Кристаллы кислотной формы барбитала.
Рис. 3. Кристаллы кислотной формы фенобарбитала.
Рис. 4. Кристаллы кислотной формы барбамила.
Рис. 5. Кристаллы кислотной формы бутобарбитала.
Рис. 6. Кристаллы кислотной формы этаминала-натрия.

9
Эту реакцию можно провести в других модификациях: к сухому остатку на предметном стекле добавляют одну каплю 10% раствора аммиака, а после растворения остатка одну каплю 10% раствора серной кислоты; через
10-15 минут наблюдают характерные сростки кристаллов. Вместо 10% раствора аммиака можно добавить кристаллы соли NaH
2
PO
4
или NaHSO
4
. Через несколько минут наблюдают выделение кислотной формы барбитурата.
3.1.4.

Реакция с дифенилкарбазоном и сульфатом ртути. К хлороформному извлечению (при больших количествах барбитуратов) или к остатку после удаления хлороформа
(при малых количествах) в пробирке добавляют 2 мл 3% раствора дифенилкарбазона в хлороформе и 2-3 мл 5% раствора HgSO
4
При наличии барбитуратов появляется сине- или красно- фиолетовое окрашивание.
3.2. Частные реакции на барбитураты
3.2.1.Реакция с хлорцинкйодом. На остаток исследуемого вещества на предметном стекле (после удаления

10
хлороформа) наносят каплю раствора хлорцинкйода.
Через 10-15 минут под микроскопом наблюдают образование кристаллических осадков. Если осадок долго не образуется, к каплям на предметных стеклах добавляют 1-2 кристалла йода и препараты снова через
10-15 минут рассматривают под микроскопом.


Рис. 7. Кристаллы продукта взаимодействия барбитала с раствором хлорцинкйода.
Рис. 8. Кристаллы продукта взаимодействия барбамила с раствором хлорцинкйода.

Рис. 9. Кристаллы продукта взаимодействия этаминала с раствором хлорцинкйода.
3.2.2.Реакция с железойодидным комплексом. К сухому остатку на предметном стекле добавляют одну каплю железойодидного комплекса; через 10-15 минут наблюдают образование характерных сростков кристаллов. Если кристаллический осадок получается слишком обильным, реакционную смесь осторожно выпаривают на предметном стекле на пламени

11
спиртовки, а к сухому остатку добавляют каплю дистиллированной воды. Через 10-15 минут препарат вновь рассматривают под микроскопом.
Рис. 10. кристаллы продукта взаимодействия этаминал-натрия с железойодидным реактивом.
Рис. 11. Кристаллы продукта взаимодействия бутобарбитала с железойодидным реактивом.
3.2.3.Реакция с меднойодидным комплексом. К сухому остатку исследуемого вещества на предметном стекле добавляют одну каплю меднойодидного комплекса; через 10-15 минут наблюдают образование кристаллических осадков.
3.2.4.Реакция со спиртовым раствором йодида калия. К сухому остатку на предметном стекле добавляют одну каплю спиртового раствора йодида калия в присутствии серной кислоты, через 5-10 минут образуются хорошо оформленные кристаллические осадки.
Рис. 12. Продукт взаимодействия бутобарбитала со спиртовым раствором калия йодида.

12
Результаты наблюдения качественных реакций занести в таблицу:
Таблица 1. Реакции обнаружения барбитуратов.
Барбитурат
Аналитический эффект

4.

ОБНАРУЖЕНИЕ И РАЗДЕЛЕНИЕ БАРБИТУРАТОВ С
ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
На стартовую линию хроматографической пластинки
«Силуфол» или «Сорбфил» наносят с помощью капилляров в виде точек стандартные (1 мг/мл) хлороформные растворы барбитуратов
(барбитал, бармамил, фенобарбитал, этаминал, бензонал, бензобамил) и хлороформное извлечение.
Пластинку хроматографируют в системе хлороформ – н-бутанол – 25% раствор аммиака в объемном соотношении 7:4:0,5. Длина пробега фронта растворителей 10 см.
После сушки пластинок при комнатной температуре в токе теплого воздуха до полного удаления растворителей пластинку равномерно опрыскивают 0,03% раствором дифенилкарбазона
(ДФК) в хлороформе, а затем водным раствором сульфата ртути.
После этого пластинку высветляют под УФ-лампой.
Барбитураты обнаруживают по сине-фиолетовым или красно- фиолетовым пятнам на исчезающем сиреневом фоне. По их расположению рассчитывают значения R
f изучаемых веществ.
Результаты заносят в таблицу 2:

13
Таблица 2. Результаты идентификации барбитуратов методов ТСХ.
Вещество (барбитурат)
R
f
Исследуемый барбитурат
Величина R
f исследуемого хлороформного извлечения и отношение его к метчикам позволяют сделать предположение о возможном присутствии одного или нескольких барбитуратов.
5.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Количественное определение барбитуратов, изолированных из биологического материала, проводят методом спектрофотометрии.
Барбитураты обладают специфической абсорбцией в ультрафиолетовой области спектра, при pH 10 и 13 и отсутствии таковой при pH 2. Максимум поглощения – 240 нм (при pH 10),
260нм (при pH 13) (рис. 13).
Предварительно необходимо определить наличие определенного барбитурата методом ТСХ.
Приготовление стандартного раствора барбитуратов.
Точную навеску барбитурата (50 мг) помещают в мерную колбу на
1000 мл и растворяют ее в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4) при осторожном перемешивании, затем объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация барбитурата составляет 50 мкг/мл.

14
Рис. 13. Спектры поглощения барбитуратов в зависимости от pH раствора
Построение калибровочного графика. В ряд мерных колб на
50 мл вносят соответственно 2, 5, 10, 15, 20 мл стандартного раствора барбитурата и доводят до метки боратным буфером (pH
10,0). Измеряют оптическую плотность растворов при λ = 240 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см.
Раствором сравнения служит боратный буфер. По средним значениям из 3 определений строят калибровочный график (рис.
13). Полученные данные заносят в таблицу:

15
Таблица 3. Данные для построения калибровочного графика.
V (раб.ст.р-ра), мл
С (барбитурата), мкг/мл
D
Рис. 14. Калибровочный график.
Количественное определение барбитуратов, изолированных из биологического материала, проводят следующим образом. 5 мл хлороформного извлечения из кислого раствора помещают в делительную воронку и экстрагируют 3 порциями боратного буфера (15, 10 и 10 мл). Объединенные водные извлечения собирают в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки боратным буфером. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при λ = 240 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см по сравнению с боратным буфером. По калибровочному графику находят содержание данного барбитурата и рассчитывают концентрацию его в исходном биологическом материале по формуле: m (мкг) = C (мкг/мл) · 50 мл
C, мкг/мл
D
D
x
C
x

16
6.

ПЛАН ЗАНЯТИЯ
1.
Рассказать преподавателю ход выполнения работы.
2.
Взять задание у преподавателя.
3.
Провести изолирование барбитуратов из биологического материала.
4.
Сдать преподавателю теоретический допуск.
5.
Провести экстракцию из спиртовой вытяжки.
6.
Провести качественные реакции на барбитураты в экстракте, сравнить с известными веществами и показать результаты преподавателю.
7.
Методом ТСХ идентифицировать неизвестный барбитурат по сравнению с метчиками известных веществ.
8.
Провести количественное определение найденного барбитурата.
9.
Сделать выводы:
О присутствии барбитуратов в анализируемом биологическом материале по качественным реакциям.
Об обнаружении неизвестного барбитурата методом ТСХ.
О количественном содержании найденного барбитурата в анализируемом биологическом материале.
Обосновать выбор метода изолирования.
10.
Написать отчет о проделанной работе и сдать его преподавателю.

17
7.

ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ
1.
Токсикологическое значение производных барбитуровой кислоты.
2.
Фармакологическое действие барбитуратов.
3.
Процессы метаболизма барбитуратов в организме человека, биомишени.
4.
Симптомы отравления барбитуратами.
5.
Написать структурные формулы данных соединений.
6.
Написать реакции синтеза барбитуровой кислоты.
7.
Физические и химические свойства барбитуратов.
8.
Таутомерия барбитуратов.
9.
Метод изолирования данных веществ из биологического материала.
10.
Очистка извлеченных барбитуратов от балластных веществ.
11.
Написать уравнения реакций данных веществ при качественном анализе.
12.
Объяснить различие спектров поглощения растворов барбитуратов при различных значениях рН.
13.
Спектрофотометрическое определение содержания барбитуратов. Ход выполнения.

18
8.

ФОРМА ОТЧЕТА
Название работы
Цель работы:

Ответы на вопросы для контроля
1.
2. и т.д.
Ход выполнения работы
ВНЕШНИЙ ОСМОТР БИОМАТЕРИАЛА:
1.
Название объекта
2.
Количество, размер
3.
Цвет
4.
Запах
5.
Состояние
Желательно структурировать ход работы по разделам:
ИЗОЛИРОВАНИЕ
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
ОБНАРУЖЕНИЕ И РАЗДЕЛЕНИЕ БАРБИТУРАТОВ С
ПОМОЩЬЮ ТСХ
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
Необходимо подробно описать все выполняемые в работе действия, написать уравнения реакций.
Вывод:

19
9.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
1. Основной метаболит производных барбитуровой кислоты:
A. глюкуронид
B.
о-карбоксифенилглюкуронид
C.
фенилпропаниламин
2. Какой метод детекции барбитуратов дает наименьший процент ложноположительных результатов?
A. ТСХ
B. ГЖХ
C. РФА
D. ИФА
E.
ультрафиолетовая спектрофотометрия
3. К экстрагентам, применяемым на II этапе изолирования, предъявляются следующие требования:
A. высокая селективность
B. удельный вес больше удельного веса воды
C. низкая температура кипения
D. способность диффундировать в клетки ткани
E. отсутствие необратимых реакций между растворителем и растворенным веществом
4. К экстрагентам, применяемым на 1 этапе изолирования токсических веществ
(твердо-жидкостная экстракция) предъявляют следующие требования:
A. высокая растворяющая способность
B. способность диффундировать в клетки ткани
C. селективность
D. несмешиваемость с водой
E.
низкая температура кипения
5. Какие способы очистки могут быть использованы после изолирования лекарственных веществ из трупного материала?
A. реэкстракция
B. осаждение белков спиртом
C. возгонка
D. тонкослойная хроматография
E. центрифугирование

20 6. При проведении общего (ненаправленного) анализа в процессе концентрирования (жидкость-жидкостная экстракция) для веществ кислого характера следует создать рН среды:
A. 5-6
B. 1-2
C. 3-4
D. 10-11
E. 7-8 7. При проведении общего (ненаправленного) анализа в процессе концентрирования (жидкость-жидкостная экстракция) для веществ основного характера следует создать рН среды:
A. 10-11
B. 7-8
C. 5-6
D. 1-2
E. 3-4 8. Общин скрининг - это:
A.
Исследование веществ, отличающихся по своему строению и принадлежащих к различным фармакологическим группам
B.
Научно обоснованная система поиска неизвестного яда, когда в процессе последовательных операций поэтапно
«отсеиваются»
(или определяются) отдельные группы веществ
C.
Направленное исследование веществ внутри группы и идентификация отдельных ее представителей
9. Механизм разделения, лежащий в основе тонкослойной хроматографии:
A.
Распределение между газовой фазой и твердым сорбентом.
B.
Различная сорбционная способность веществ
C.
Распределение между жидкостью (под давлением) и твердой фазой
D.
Распределение между газовой фазой и высококипящей жидкостью

21
E.
Обмен ионами между веществом и сорбентом
10. Качественной характеристикой в тонкослойной хроматографии является:
A.
Время удерживания
B.
Котангенс угла α
C.
Ширина и площадь пика
D.
Значение Rf
E.
Высота пика
11. Частной системой в ТСХ-скрининге при исследовании производных барбитуровой кислоты является:
A.
Этилацетат-метанол-25 % раствор аммиака (17:2:1)
B.
Хлороформ - н-бутанол - 25 % раствор аммиака
(70:40:5)
C.
Диоксан - хлороформ - ацетон - 25 % раствор аммиака (47,5:45.5:2,5)
D.
Хлороформ - ацетон (9.1)
E.
Толуол - ацетон - этанол - 25 % раствор аммиака
(45:45:7,5:2,5)
12. В ГЖХ неподвижной фазой является:
A. Силикагель
B. Твердый носитель
C.
Жидкость, нанесенная на твердый носитель
D.
Газ
E.
Пористый газ
13. Качественное обнаружение компонентов хроматографируемой смеси в газожидкостной хроматографии проводят по:
A.
Площади пика
B.
Времени удерживания
C.
Высоте пика
D.
Коэффициенту емкости
E.
Разрешению Rs и фактору разделения α
14. В основе количественного определения барбитуратов методом
УФ-спектрофотометрии лежат:

22
A.
Кислотные свойства
B.
Амфотерные свойства
C.
Способность к таутомерным превращениям при изменении рН
D.
Способность к образованию аци-солей
15. Произошло отравление барбитуратами. Какой из реактивов не используется при обнаружении барбитуратов?
A.
Марки
B.
хлорцинкйод
C.
медно-пиридиновый
D.
дифенилкарбазид и ртути сульфат
E.
железойодидный
16. Одним из методов обнаружения барбитуратов является ТСХ- скрининг. Обнаружение данной группы веществ при ТСХ- скрининге проводят с использованием проявителей:
A.
Марки
B.
дифенилкарбазида и ртути сульфата
C.
дифениламина
D.
натрия диэтилдитиокарбамата
E.
реактива Драгендорфа
F.
паров йода
17. Исследуемая судебно-медицинским токсикологом вытяжка, полученная из проб мочи, дала положительный результат мурексидной пробы.
Какая группа веществ может присутствовать?
A.
Барбитураты
B.
Фенотиазины
C.
Бензодиазепины
D.
хлорорганические соединения
E.
производные индола
18. Произошло отравление фенобарбиталом. Какой из методов количественного определения на барбитураты является наиболее точным и чувствительным?

23
A.
дифференциальная спектрофотометрия в УФ- области спектра
B.
прямая спектрофотометрия в УФ-областй спектра
C.
фотоколориметрический
D.
экстракционно-фотометрический

24
СОДЕРЖАНИЕ
Введение…………………………………………………………...3
Изолирование……………………………………………………...3
Качественный анализ……………………………………………..6
Обнаружение и разделение барбитуратов с помощью тонкослойной хроматографии…………………………………...12
Количественный анализ………………………………………….13
План занятия………..…………………………………………….16
Вопросы для контроля…………………………………………...17
Форма отчета……………………………………………….…….18
Тестовые задания….……………………………………………..19

: resources -> directory
directory -> Рабочая программа дисциплина: хирургическая стоматология и челюстно-лицевая хирургия Факультет: стоматологический
directory -> Лазерная терапия
directory -> Вопросы к зачету по производственной практике для студентов 3 курса стоматологического факультета «помощник врача-стоматолога (гигиенист)»
directory -> Диспансеризация детей и подростков у врача-стоматолога детского на терапевтическом приеме
directory -> Вопросы к экзамену по производственной практике на 4 курсе стоматологического факультета
directory -> Клинический случай лечения с премедикацией периапикального абсцесса без свища
directory -> Лекций по терапевтической стоматологии для студентов 4 курса стоматологического факультета на 2016-2017 учебный год
directory -> План практических занятий для студентов 4 курса стоматологического факультета на 2016-2017 учебный год, 7




База данных защищена авторским правом ©stomatologo.ru 2017
обратиться к администрации

    Главная страница